Chapitre 6 - Échantillons et exigences des analyses de laboratoire

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Table des matières

6.1 Protocole de prélèvement d'échantillons pour les aliments du bétail

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Anna Lamberti
Section de l'évaluation des aliments du bétail et de la nutrition
Division des aliments pour animaux

6.2 Protocole de bonnes pratiques d'analyse pour l'évaluation d'ingrédients pour le bétail

Dans le cadre du processus d'approbation, par l'ACIA, des nouveaux ingrédients et des analyses garanties, on demande aux détenteurs d'homologation de présenter une méthode acceptable d'analyse dans les aliments complets. Le protocole suivant a pour but de permettre aux titulaires d'homologation de mettre au point une méthode et des matériels d'analyse satisfaisants, de façon à accélérer l'acceptation de la méthodologie utilisée.

Dans chacune de ses présentations, le titulaire doit faire état d'une méthode qui se révèle spécifique, sélective, fiable et exacte pour l'analyse de la matière active présente dans les produits de qualité technique, les prémélanges et les produits formulés. La présentation doit comprendre les éléments suivants, qui permettront à l'Agence d'évaluer correctement la (ou les) méthode (s) utilisée (s) :

1.

La (ou les) méthode (s) doit (doivent) être récente (s) et employée (s) par le fabricant qui fait la présentation. Celui-ci doit fournir les renseignements suivants sur chaque méthode :

  1. Une description claire et concise de la méthode.
  2. Une description des normes de rendement de la méthode, notamment :
    1. le taux de récupération acceptable;
    2. l'écart dans les résultats d'analyse (minimum et maximum);
    3. le seuil d'analyse quantitative;
    4. le seuil de détection;
    5. le coefficient de variation (CV) en pourcentage de la répétabilité de l'expérience (à l'intérieur d'un même laboratoire);
    6. le CV en pourcentage de la reproductibilité de l'expérience (entre laboratoires), si disponible.

    Définitions
    Seuil de détection = X + 3 o
    Seuil d'analyse quantitative = X + 10 o,
    où X est la valeur moyenne d'un essai à blanc et o l'écart-type (réputé constant aux concentrations relativement faibles de X).

  3. La détermination des points de contrôle critiques et autres spécifications (p. ex. à l'étape 5.3, la température d'évaporation sera de 35°C ± 3°C).
  4. La description du protocole expérimental utilisé pour évaluer la méthode [la (ou les) évaluation (s) devrait (devraient) comprendre des étudies de récupération sur divers essais à blanc d'aliments à concentrations connue et avec une méthode d'enrichissement aussi connue].
  5. Les résultats d'évaluation de la méthode sous forme tabulaire, accompagnés d'une analyse statistique.
  6. La preuve d'études d'interférence avec des médicaments et des additifs alimentaires d'usage courant, et la description des interférences connues.
  7. Des chromatogrammes (pour la CLHP ou la CPG) d'étalons et de produits de qualité technique, ainsi que de tous les blancs, échantillons d'aliments du bétail et prémélanges utilisés dans la (ou les) évaluation(s) de la méthode, accompagnés des commentaires pertinents.
  8. Les donnés brutes et les résultats mesurés permettant d'évaluer avec exactitude et précision les prémélanges et les diverses compositions d'aliments complets qui seront fabriqués (les aliments contenant divers ingrédients propres aux espèces animales visées).

2.

Une fois les exigences ci-dessus respectées, l'ACIA aliments fera généralement l'essai de la méthode réputée la plus acceptable. Pour cet essai, le fabricant doit fournir les matériels suivants :

  1. Un minimum de cinq aliments complets formulés différemment, c.-à-d. contenant divers ingrédients (pour chaque aliment, fournir un blanc et un échantillon enrichi), et trois prémélanges additionnés de l'ingrédient en question (au moins 1 kg chacun). La quantité d'ingrédient ajouté aux échantillons soumis doit être analysée par le fabricant, qui doit indiquer la méthode d'analyse utilisée.
  2. Exactement cinq (5) grammes d'étalon analytique et dix (10) grammes de deux lots de produit technique, le degré de pureté (%) figurant sur les étiquettes.

3. Il est recommandé de fournir une méthode de rechange pour confirmer les résultats (c.-à-d. spectrométrie de masse, chromatographie sur couches minces, etc.)

4. Le fabricant doit également fournir une méthode d'analyse de résidus qui est capable de quantifier 1% de la plus faible concentration de l'ingrédient lorsque celui-ci ou la matière active est réputé(s) toxique pour certaines espèces animales.

Une fois la (ou les) méthode (s) évaluée (s), il est recommandé que le fabricant et l'Agence collaborent pour l' (ou les) étudier.

La (ou les) méthode (s) sera (seront) intégrée (s) au Manuel des méthodes de la Division des services de laboratoire et sera (seront) donc accessible (s) au public sur demande dès que l'analyse garantie concernant l'ingrédient sera acceptée par les autorités compétentes.

Le fabricant doit informer la Division des aliments pour animaux de toute nouvelle méthode utilisée ou modification apportée à la méthode existante. En effet, la Direction générale des sciences doit vérifier l'acceptabilité des nouvelles méthodes ou des modifications, même si le degré de vérification dépend de leur incidence et des modifications apportées.

Directives sur l'évaluation des méthodes servant à déterminer la viabilité des produits microbiens à administration orale pour le bétail et des additifs pour fourrages contenant des micro-organismes viables (anciennement T-3-151-s1)

L'homologation des produits microbiens à administration orale pour le bétail ou des additifs pour fourrages contenant des micro-organismes viables réalisée par l'ACIA exige, entre autres, que le demandeur fournisse une méthode acceptable de dosage des micro-organismes présents dans le support ou la charge. Le demandeur est aussi dans l'obligation de fournir les données nécessaires pour étayer la fiabilité de cette méthode. Le protocole suivant a pour but de vérifier si la méthode, les données et le matériel d'analyse fournis par le demandeur permettent effectivement de procéder rapidement à l'évaluation, à la validation et à l'approbation de la méthode.

1. Méthode soumise

La présentation de la méthode a pour but de permettre à l'évaluateur et à l'analyste de comprendre celle-ci et de l'exécuter exactement comme l'entendait l'auteur. Il faut donc que la méthode contienne toute l'information nécessaire, présentée sous forme de mode opératoire normalisé, détaillé étape par étape.

Cette méthode doit être claire et concise et être en usage dans l'entreprise demandeuse. Il doit être prouvé qu'elle est spécifique, sélective, fiable et exacte pour le dénombrement des micro-organismes viables dans les produits formulés. Elle doit également comporter des points de contrôle critiques ainsi que des spécifications pour le contrôle de la qualité et la familiarisation.

La demande doit contenir aussi les documents suivants sur les normes de performance pour que la méthode soit bien évaluée :

  • Description du ou des micro-organismes ajoutés au produit, y compris l'identification de la souche et la source;
  • Indication des concentrations de micro-organismes garanties dans le produit, exprimées en cellules souches unipotentes (UFC) par g ou ml;
  • Énoncé de la portée et des principes de la méthode;
  • Liste des renvois (références) étayant la méthode;
  • Description des réactifs et des appareils, y compris les critères de rendement et l'information précise sur les commandes;
  • Description du protocole expérimental, assorti du mode opératoire normalisé complet servant à évaluer la méthode - cette description devrait comprendre de l'information sur la préparation des échantillons ainsi que sur les méthodes servant à analyser les échantillons, les témoins et les étalons;
  • Indication des points de contrôle critiques et des spécifications, y compris l'information sur la stabilité des réactifs et des échantillons, et les précisions sur l'existence possible de substances brouillant les résultats de la réaction (par exemple un organisme non visé), des composantes de la matrice de prélèvement, des additifs chimiques, des médicaments, etc.
  • Information sur la sécurité ainsi que les précautions à prendre;
  • Toute information existante sur les études menées en collaboration;
  • Toute autre information pertinente.
  • Lorsque la méthode présentée diffère de celles fondées sur le comptage des colonies, par exemple une méthode basée sur l'ELISA, les sondes nucléiques, la bioluminescence, etc., il peut être nécessaire, tout dépendant des besoins, d'ajouter de l'information supplémentaire, comme les courbes d'étalonnage, les données sur la spécificité et celles sur la sensibilité.

2. Données à l'appui

Le demandeur doit fournir l'information suivante pour étayer la méthode proposée, c'est-à-dire les données brutes et les analyses statistiques obtenues par sa propre évaluation de la méthode (les données doivent être présentées sous forme de tableau) :

  • Les résultats de l'analyse de trois lots de production, chacun analysé trois fois (indiquer les numéros de lot), y compris les calculs des UFC/g ou ml et les coefficients de variation pour une évaluation de la précision de la méthode;
  • Les résultats d'analyse obtenus différents jours, par différents analystes, pour différents lots de réactifs ou dans différents laboratoires, y compris les calculs des UFC/g ou ml et des coefficients de variation pour les évaluations de la répétabilité et de la reproductibilité de la méthode;
  • Lorsqu'il existe une méthode de référence, les résultats d'analyse, y compris ceux des calculs des UFC/g ou ml obtenus avec celle-ci, pour montrer le degré de précision de la méthode soumise par rapport à la méthode de référence;
  • Les données d'analyse confirmant la sélectivité de la méthode par l'isolement réussi du micro-organisme cible - on peut réussir l'identification à partir de résultats de la coloration de Gram, de la morphologie des cellules, d'analyses biochimiques, de courbes d'utilisation des hydrates de carbone ou toute autre épreuve de confirmation valide;
  • Lorsque la méthode présentée a pour objet le dosage de contaminants microbiens ou des micro-organismes décelés en faible concentration, les résultats d'analyse établissant les limites de détection.

3. Évaluation par un laboratoire de l'ACIA

Lorsque les conditions ci-dessus sont satisfaites, l'ACIA procédera à une étude des documents suivie d'une évaluation de la méthode en laboratoire. À cette fin, le matériel suivant doit être fourni par l'entreprise :

  • Une quantité suffisante de la culture pure ou d'un mélange de cultures;
  • Une quantité suffisante de la matrice de prélèvement, du support ou de la charge (au moins 250 g) non inoculés;
  • Une quantité suffisante d'échantillons du produit (pour 5 analyses par lot) prélevés des mêmes trois lots de production qui ont été analysés antérieurement par l'entreprise (voir 2. Données à l'appui);
  • Tout milieu, réactif ou appareil inhabituels que nécessite la méthode.

4. Critères d'évaluation

L'approbation de la méthode de dénombrement du ou des micro-organismes se fera d'après des critères de spécificité, d'exactitude, de précision, de répétabilité et de reproductibilité, compte tenu des résultats d'analyse fournis par l'entreprise et ceux produits par l'ACIA.

5. Rapport d'ACIA

Sur demande, l'ACIA rédigera un rapport comprenant l'information suivante :

  • Titre, nom du demandeur, nom du laboratoire et des évaluateurs de l'ACIA et date du rapport;
  • Déclaration sommaire indiquant si la méthode est acceptée ou rejetée, avec signatures et dates;
  • Résultats de l'évaluation des données fournies par le demandeur et données obtenues par le laboratoire de l'ACIA, avec comparaisons;
  • Tableaux indiquant les données brutes, les calculs et les analyses statistiques servant à déterminer la spécificité, l'exactitude, la précision, la répétabilité et la reproductibilité de la méthode présentée;
  • Discussion et conclusions.

6. Changements apportés à la méthode

L'ACIA doit être informé de toute modification apportée à la méthode. La méthode nouvelle ou modifiée doit être soumise à une étude des documents. Le degré de vérification dépendra des changements.

6.3 Lignes directrices pour l'évaluation des méthodes pour déterminer l'activité des ingrédients enzymatiques utilisés dans les aliments du bétail

Une partie du procédé visant à l'enregistrement des aliments du bétail contenant des enzymes par l'ACIA est la soumission par l'applicant d'une méthode appropriée pour l'analyse du ou des enzyme(s) dans l'excipient/support. L'applicant doit également fournir les données nécessaires pour supporter la fiabilité de la méthode. Le protocole ici présenté vise à assurer que la méthode, les données et le matériel d'analyse soumis par l'applicant soient adéquats pour permettre une évaluation, validation et approbation rapide de la méthodologie.

1. Structure de la méthode

Le but de la description de la méthode est de permettre à l'évaluateur et à l'analyste de comprendre et de reproduire la méthode exactement tel que le désirait l'auteur. Il est donc nécessaire que la méthode contienne toutes les informations nécessaires présentées étape par étape dans un mode opératoire standard.

La méthode soumise doit être claire, concise et en usage courant dans la compagnie qui fait application. Il doit avoir été prouvé que la méthode est spécifique, sélective, fiable et précise pour la détermination de l'ingrédient actif (dans les formulations commerciales). La méthode doit contenir des instructions détaillées pour la préparation de la courbe standard, les équations nécessaires pour calculer l'activité et la définition de l'unité d'activité. Les points de contrôle critiques, les spécifications pour le contrôle de la qualité et pour la familiarisation doivent aussi être inclus dans la méthodologie. Une méthode manuelle et de base devra être présentée également dans le cas où la méthode en usage courant nécessite un équipement hautement spécialisé, coûteux ou automatisé.

Les documents justificatifs des critères de performance de la méthode doivent être inclus pour une évaluation appropriée (veuillez présenter les données sous forme de tableau.)

La description de la méthode devrait inclure :

  • Applicabilité et principe de la méthodologie.
  • Références.
  • Description des réactifs et de l'équipement ainsi que les informations pertinentes à l'achat des réactifs et des critères de performance des réactifs et de l'équipement.
  • Indications pour la préparation, l'entreposage et la stabilité des étalons analytiques et des réactifs.
  • Préparation et stabilité de l'échantillon.
  • Paramètres opérationnels et performance anticipée des instruments.
  • Procédure pour l'analyse des échantillons, contrôles et étalon.
  • Équations pour le calcul de la concentration ou de la puissance, instructions pour la construction de la courbe standard et exemple d'utilisation des équations.
  • Définition de l'unité.
  • Informations concernant les études collaboratives.
  • Données de conformité du système (normes statistiques de la méthode).
  • Substances interférentes.
  • Information sur la sécurité et les précautions à prendre.

2. Pièces justificatives

Le répondant doit fournir les informations suivantes pour supporter la méthodologie proposée; normes de performance, points critiques, entreposage des échantillons, etc. :

Courbe standard

L'applicant doit fournir de l'information concernant la fiabilité statistique de la courbe standard utilisée (directement ou indirectement) pour mesurer l'activité enzymatique.

Indiquer l'intervalle analytique (maximum et minimum)

  • Indiquer le seuil de quantification,
  • Indiquer le seuil de détection.

Fournir trois ensembles de données de calibration de courbe standard ainsi que le graphique (minimum cinq points). Pour chaque ensemble, fournir les données statistiques supportant la fiabilité de la courbe :

  • indiquer la pente et le point d'intersection de la courbe,
  • indiquer le coefficient de linéarité.

Fournir une comparaison statistique des trois courbes de standardisation.

Analyse enzymatique

Généralement, l'analyse de l'activité devrait être exécutée sur plusieurs dilutions pour la quantification de l'activité.

Présenter un minimum de trois ensembles de graphiques d'analyses d'enzyme (minimum 5 points) pour la détermination de la linéarité et de l'intervalle analytique. Spécifier la région linéaire.

Dans l'éventualité où un enzyme étalon certifié ne serait pas disponible, fournir les données statistiques justifiant l'usage d'un étalon maison (c.-à-d., fournir les données d'analyses précédentes avec comparaisons statistiques.)

Fournir les résultats pour l'analyse de trois lots (indiquer les numéros de lot) de produit enzymatique (chacun analysé en triple) pour la détermination de l'exactitude, la précision, spécificité, variance et pourcentage d'erreur.

Indiquer le pourcentage acceptable de recouvrement d'activité enzymatique.

Indiquer le coefficient de variation relatif de la répétitivité (interne).

Indiquer le coefficient de variance relatif de reproductibilité (entre laboratoires) si possible.

3. Description du projet expérimental d'évaluation de la méthode

Fournir une description du projet expérimental utilisé par la compagnie ou un autre laboratoire pour l'évaluation de la méthode. Inclure les données brutes et l'analyse statistique de l'évaluation de la méthode.

4. Évaluation en laboratoire par l'ACIA

Une fois que les conditions ci-haut mentionnées seront remplies, les laboratoires de l'ACIA procédera à l'évaluation de la méthode. Au moment où la méthode sera testée par les laboratoires de l'ACIA, le matériel suivant doit être fourni par la compagnie.

  • Quantité appropriée d'enzyme pure standard ou de produit à quantifier pour construire la courbe standard.
  • Quantité suffisante d'échantillon pour permettre cinq analyses en double à chaque niveau de garantie (composition, formulation). Si possible, fournir les mêmes échantillons que ceux utilisés pour générer les données.
  • Quantité suffisante de substrat pour les analyses.
  • Tout réactif inhabituel requis par la méthodologie.

5. Critères d'évaluation

Les critères suivants seront utilisés comme guide pour l'évaluation de la méthodologie :

  • Facteur de régression de 0,995 ou mieux pour les courbes d'étalonnage
  • Recouvrement de 95-110 %
  • Coefficient de variation intra laboratoire de 5 %.

6. Rapport l'ACIA

Sur demande, l'ACIA préparera un rapport qui incluera les informations suivantes :

  • Page couverture contenant : titre, répondant, identification du laboratoire de l'ACIA, nom et titre de l'évaluateur, date de publication.
  • Énoncé sommaire indiquant l'acceptation ou le rejet de la méthode avec signatures et dates.
  • Résultat de l'évaluation des données fournies par l'applicant.
  • Résultat de l'évaluation de l'analyse du laboratoire de l'ACIA.
  • Comparaisons des données de la soumission et de l'évaluation de l'ACIA.
  • Données brutes, statistiques, tableaux.
  • Discussion.
  • Conclusion.

7. Modifications de la méthodologie

L'ACIA doit être informée de toute modification ou nouvelle méthodologie utilisée. La nouvelle méthodologie ou les changements doivent être vérifiés. Toutefois, le niveau de vérification dépendra de la nature et de l'impact des modifications.

Date de modification :