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Données de la caractérisation moléculaire

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Introduction

En juillet 1998, des agents de réglementation de l'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA), de Santé Canada (SC) et de l'Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS) de l'United States Department of Agriculture (USDA) se sont réunis pour comparer, et harmoniser dans la mesure du possible, certains aspects de la caractérisation moléculaire qui font partie intégrante de leurs évaluations des végétaux transgéniques. La conclusion d'un accord sur des exigences communes et des méthodes d'analyse acceptables pour la caractérisation moléculaire facilitera la présentation de données justificatives par des promoteurs qui cherchent à faire approuver, par la réglementation, l'intégration de ces végétaux dans la production ou le commerce agricole des deux pays. La présente annexe est l'un des fruits de cette réunion. Elle résume et détermine les ressemblances et les différences dans les éléments déterminants de la caractérisation moléculaire des végétaux transgéniques examinés lors des évaluations par ces organismes participants. La caractérisation moléculaire ne représente qu'une partie de l'ensemble de l'information examinée au cours des évaluations de ces végétaux effectuées avant leur commercialisation.

La portée du présent document se limite à l'examen du processus de transformation et des vecteurs utilisés au cours de la transformation; du matériel génétique potentiellement transmis à la plante receveuse; de la détermination, de l'hérédité, et de l'expression du matériel génétique dans la plante transgénique, ainsi que de la production des nouvelles protéines codées par le matériel génétique introduit. Le présent document ne porte pas sur certains types de techniques ni certaines pratiques d'assurance-qualité (p. ex., bonnes pratiques de laboratoire) utilisées pour produire des données de la caractérisation moléculaire.

Les organismes ont trouvé des points de convergence très substantiels dans les différents types de données de la caractérisation moléculaire qui doivent être présentées et examinées. Outre les séries de données examinées, les participants des deux pays ont réaffirmé que les examens sont encore effectués au cas par cas pour permettre l'évaluation de données supplémentaires ou moindres, selon le produit soumis pour examen et les pouvoirs de réglementation de chaque organisme participant. L'utilisation du mot « peut » dans le présent document tient compte d'une partie de cette latitude nécessaire à la détermination des situations pour lesquelles les séries de données seront jugées comme partie intégrante d'une demande d'autorisation. Par conséquent, les consultations entre les organismes de réglementation et chaque demandeur sont considérées comme étant un élément important du processus de préparation d'une demande pour faire ce genre de déterminations.

Les éléments essentiels de la caractérisation moléculaire des végétaux transgéniques décrits plus bas s'appliquent aux demandes d'évaluation soumises aux organismes participants, tant au Canada qu'aux États-Unis, sauf avis contraire. Le contenu du présent document sera examiné et modifié au besoin par ces organismes. Le glossaire qui suit donne la définition de certains termes dans le contexte du présent document.

Glossaire

ADN porteur
L'ADN utilisé pour accélérer la préparation ou la transformation du matériel génétique dans une plante, mais qui ne fait pas partie de la construction.
Région codante
Une séquence d'ADN qui peut être traduite de façon à produire une protéine. Synonyme de cadre ouvert de lecture.
Construction génétique
Un fragment d'ADN génétiquement manipulé (p. ex., plasmide) qui contient, sans y être limité, des séquences d'ADN à intégrer dans le génome de la plante cible
Citations de base de données
Sources d'information publiques sur les séquences nucléotidiques ou de protéines. Les quatre bases de données et leurs adresses internet couramment utilisées sont :

GenBank : Une collection annotée de toutes les séquences d'ADN publiquement accessibles, conservée par l'Institut national de la santé (INS). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenbankOverview.html

Banque de données nippones sur l'ADN (DNA Data Bank of Japan) (anglais seulement)  : La banque d'ADN officiellement certifiée du Japon, qui recueille des séquences d'ADN des chercheurs. http://www.ddbj.nig.ac.jp/

Séquence de nucléotides du EMBL : Une base de données sur des séquences d'ADN et d'acide ribonucléique prélevées des publications scientifiques, des demandes de brevets et directement présentées par des chercheurs et des groupes de séquençage. http://www.ebi.ac.uk/embl/

La Banque de données sur les séquences de protéines SWISS-PROT : Une base de données sur des séquences de protéines produites en collaboration par Amos Bairoch (Université de Genève) et l'EBI. http://www.ebi.ac.uk/swissprot/

Insert
La partie d'une construction (voir ci-dessus) qui est intégrée au génome de la plante receveuse.
Régions non-codantes
Des séquences d'ADN situées à l'extérieur d'un cadre de lecture ouvert et qui ne sont pas traduites. Elles peuvent inclure des régions de fixation charpentière, des promoteurs, des séquences de signaux peptidiques, des activateurs, des introns, des terminateurs et toute autre séquence utilisée pour l'expression des gènes dans la plante ou d'autres hôtes, comme les origines de la réplication, les éléments transposables, les limites de l'ADN-T, les séquences lox, etc.
Stabilité
L'expression uniforme, fiable et prévisible du caractère transgénique dans la lignée végétale transformée et les lignées végétales issues de celle-ci.
Caractère(s)
Le(s) caractère(s) phénotypique(s) conféré(s) à la plante receveuse par l'insert transgénique.
Vecteur
Une molécule d'ADN capable de réplication autonome dans laquelle de l'ADN étranger est inséré et ensuite multiplié dans une cellule hôte.

Caractérisation Moléculaire des Végétaux Transgéniques

1 Le système de transformation

2 Hérédité et stabilité des caractères introduits et fonctionnels chez la plante

3 Caractérisation de l'ADN inséré dans la plante

4 Caractérisation et expression des protéines et de l'ARN 

Tableau 1 : Exemple d'un tableau qui décrit les éléments d'ADN d'un vecteur

Résumé d'éléments d'ADN chez PV-STBT02
(tiré du tableau III.1 de la demande de l'APHIS no 94-257-01p)
Élément génétique TailleNotes de tableau 1
(ko)
Fonction et source
BD 0.36 Fragment de restriction du plasmide pTiT37 contenant les 24 pb de la bordure droite (BD) de l'ADN-T de type nopaline, utilisé pour amorcer le transfert de l'ADN-T de la bactérie Agrobacterium tumefaciens au génome de la plante (Depicker et al., 1982).
E35S 0.62 Le promoteur du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) (Odell et al., 1985) avec la région activante dupliquée (Kay et al., 1987).
cryIIIA 1.8 Gène qui confère la résistance au doryphore de la pomme de terre (DPT). Le gène code une séquence d'acides aminés identique à celle de la protéine toxique pour le DPT (dite protéine de la bande 3 du Btt) trouvée chez Bacillus thuringiensis variété tenebrionis, tel que signalé par Perlak et al. (1993).
E9 3' 0.63 Une région 3' non traduite de la petite sous-unité de ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase du gène E9 (rbcS) chez le poi (Coruzzi et al., 1984), qui a pour fonction de terminer la transcription et de diriger la polyadénylation de l'ARN messager cryIIIA.
NOS 3' 0.26 Région 3' non traduite du gène de la nopaline synthase qui a pour fonction de terminer la transcription et de diriger la polyadénylation de l'ARNm du gène nptII (Depicker et al., 1982; Bevan et al., 1983).
nptII 0.79 Le gène isolé de Tn5 (Beck et al., 1982) qui code pour la néomycine phosphotransférase type II. L'expression de ce gène chez les cellules végétales confère de la résistance à la kanamycine et sert de marqueur de sélection pour la transformation (Fraley et al., 1983).
35S 0.32 Promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) (Gardner et al., 1981; Sanders et al., 1987).
LB 0.45 Un fragment de restriction du plasmide Ti de l'octopine, pTi15955, contenant les 24 pb de la limite gauche de l'ADN-T, a servi à terminer le transfert de l'ADN-T de la bactérie Agrobacterium tumefaciens au génome de la plante (Barker et al., 1983).
ori V 1.3 Segment comportant l'origine de la réplication de la souche Agrobacterium tumefaciens ABI provenant du plasmide RK2 à large spectre d'hôtes (Stalker et al., 1981).
ori-322/rop 1.8 Un segment de pBR322 qui assure l'origine de la réplication pour le maintien du plasmide PV-STBT02 chez E. coli, la réplication de la région de l'amorce (rop) et du site bom pour le transfert conjugationnel dans les cellules de Agrobacterium tumefaciens (Bolivar et al., 1977; Sutcliffe, 1978).
aad 0.93 Fragment isolé du transposon Tn7 contenant un gène de 0,79 kb codant l'enzyme streptomycine adénylyltransférase et permettant de sélectionner les bactéries sur un milieu contenant de la spectinomycine ou de la streptomycine (Fling et al., 1985).

Notes de tableau

Note de tableau 1

Les tailles sont approximatives.

Retour à la référence de la note de tableau 1

Figure 1 : Exemple d'une carte détaillée d'un vecteur plasmidique

Exemple d'une carte détaillée d'un vecteur plasmidique. Description ci-dessus.
Description pour : Exemple d'une carte détaillée d'un vecteur plasmidique

Ci-dessus sont démontrés les sites de restriction et leurs emplacements en paires de bases ayant été utilisés lors des analyses de transfert de Southern. La région de l'ADN-T est indiquée, de même que ses limites droite et gauche qui sont déterminées par des flèches ouvertes. Les régions noircies indiquent l'emplacement de l'homologie des sondes par PCR utilisées lors des analyses de Southern. On peut voir également les sites de restriction des enzymes de restriction HindIII, EcoRI, XhoI, et NotI.

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