Données de la caractérisation moléculaire

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Introduction

En juillet 1998, des agents de réglementation de l'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA), de Santé Canada (SC) et de l'Animal and Plant Health Inspection Service (APHIS) de l'United States Department of Agriculture (USDA) se sont réunis pour comparer, et harmoniser dans la mesure du possible, certains aspects de la caractérisation moléculaire qui font partie intégrante de leurs évaluations des végétaux transgéniques. La conclusion d'un accord sur des exigences communes et des méthodes d'analyse acceptables pour la caractérisation moléculaire facilitera la présentation de données justificatives par des promoteurs qui cherchent à faire approuver, par la réglementation, l'intégration de ces végétaux dans la production ou le commerce agricole des deux pays. La présente annexe est l'un des fruits de cette réunion. Elle résume et détermine les ressemblances et les différences dans les éléments déterminants de la caractérisation moléculaire des végétaux transgéniques examinés lors des évaluations par ces organismes participants. La caractérisation moléculaire ne représente qu'une partie de l'ensemble de l'information examinée au cours des évaluations de ces végétaux effectuées avant leur commercialisation.

La portée du présent document se limite à l'examen du processus de transformation et des vecteurs utilisés au cours de la transformation ; du matériel génétique potentiellement transmis à la plante receveuse ; de la détermination, de l'hérédité, et de l'expression du matériel génétique dans la plante transgénique, ainsi que de la production des nouvelles protéines codées par le matériel génétique introduit. Le présent document ne porte pas sur certains types de techniques ni certaines pratiques d'assurance-qualité (p. ex., bonnes pratiques de laboratoire) utilisées pour produire des données de la caractérisation moléculaire.

Les organismes ont trouvé des points de convergence très substantiels dans les différents types de données de la caractérisation moléculaire qui doivent être présentées et examinées. Outre les séries de données examinées, les participants des deux pays ont réaffirmé que les examens sont encore effectués au cas par cas pour permettre l'évaluation de données supplémentaires ou moindres, selon le produit soumis pour examen et les pouvoirs de réglementation de chaque organisme participant. L'utilisation du mot « peut » dans le présent document tient compte d'une partie de cette latitude nécessaire à la détermination des situations pour lesquelles les séries de données seront jugées comme partie intégrante d'une demande d'autorisation. Par conséquent, les consultations entre les organismes de réglementation et chaque demandeur sont considérées comme étant un élément important du processus de préparation d'une demande pour faire ce genre de déterminations.

Les éléments essentiels de la caractérisation moléculaire des végétaux transgéniques décrits plus bas s'appliquent aux demandes d'évaluation soumises aux organismes participants, tant au Canada qu'aux États-Unis, sauf avis contraire. Le contenu du présent document sera examiné et modifié au besoin par ces organismes. Le glossaire qui suit donne la définition de certains termes dans le contexte du présent document.

Glossaire

ADN porteur

L'ADN utilisé pour accélérer la préparation ou la transformation du matériel génétique dans une plante, mais qui ne fait pas partie de la construction.

Région codante

Une séquence d'ADN qui peut être traduite de façon à produire une protéine. Synonyme de cadre ouvert de lecture.

Construction génétique

Un fragment d'ADN génétiquement manipulé (p. ex., plasmide) qui contient, sans y être limité, des séquences d'ADN à intégrer dans le génome de la plante cible

Citations de base de données

Sources d'information publiques sur les séquences nucléotidiques ou de protéines. Les quatre bases de données et leurs adresses internet couramment utilisées sont :

GenBank : Une collection annotée de toutes les séquences d'ADN publiquement accessibles, conservée par l'Institut national de la santé (INS). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/GenbankOverview.html

Banque de données nippones sur l'ADN : La banque d'ADN officiellement certifiée du Japon, qui recueille des séquences d'ADN des chercheurs. http://www.ddbj.nig.ac.jp/fromddbj-e.html

Séquence de nucléotides du EMBL : Une base de données sur des séquences d'ADN et d'acide ribonucléique prélevées des publications scientifiques, des demandes de brevets et directement présentées par des chercheurs et des groupes de séquençage. http://www.ebi.ac.uk/embl/

La Banque de données sur les séquences de protéines SWISS-PROT : Une base de données sur des séquences de protéines produites en collaboration par Amos Bairoch (Université de Genève) et l'EBI. http://www.ebi.ac.uk/swissprot/

Insert

La partie d'une construction (voir ci-dessus) qui est intégrée au génome de la plante receveuse.

Régions non-codantes

Des séquences d'ADN situées à l'extérieur d'un cadre de lecture ouvert et qui ne sont pas traduites. Elles peuvent inclure des régions de fixation charpentière, des promoteurs, des séquences de signaux peptidiques, des activateurs, des introns, des terminateurs et toute autre séquence utilisée pour l'expression des gènes dans la plante ou d'autres hôtes, comme les origines de la réplication, les éléments transposables, les limites de l'ADN-T, les séquences lox, etc.

Stabilité

L'expression uniforme, fiable et prévisible du caractère transgénique dans la lignée végétale transformée et les lignées végétales issues de celle-ci.

Caractère(s)

Le(s) caractère(s) phénotypique(s) conféré(s) à la plante receveuse par l'insert transgénique.

Vecteur

Une molécule d'ADN capable de réplication autonome dans laquelle de l'ADN étranger est inséré et ensuite multiplié dans une cellule hôte.

Caractérisation Moléculaire des Végétaux Transgéniques

1 Le système de transformation

• 1.1 Description de la méthode de transformation
  • 1.1.1 Décrire et fournir des références pour la méthode de transformation, p. ex., la transformation par Agrobacterium ou la transformation directe par des méthodes comme le bombardement de particules, l'électroporation, la transformation de protoplastes par du P.E.G., etc.
  • 1.1.2 Pour ce qui est des méthodes de transformation directe, décrire la nature et la source de tout ADN porteur utilisé.
  • 1.1.3 Pour la transformation par Agrobacterium, désigner la souche d'Agrobacterium utilisée au cours du processus de transformation et indiquer comment le vecteur basé sur le plasmide Ti a été désarmé, et si Agrobacterium a été éliminé du tissu transformé.
  • 1.1.4 Pour ce qui des systèmes de transformation autres que par Agrobacterium, fournir l'information suivante :
    • 1.1.4.1 Le système utilise-t-il un agent pathogène ou des séquences d'acides nucléiques d'un agent pathogène ?
    • 1.1.4.2 Comment les séquences liées à la pathogenèse ont-elles été extraites avant la transformation ?
    • 1.1.4.3 Le processus de transformation comporte l'utilisation de plasmides auxiliaires ou d'un mélange de plasmides ? Dans l'affirmative, les décrire en détail.
• 1.2 Description du matériel génétique potentiellement transmis au matériel végétal receveur (la modification/les constructions).
  • 1.2.1 Fournir un résumé de tous les éléments génétiques qui composent le vecteur, y compris des régions codantes et des séquences non codantes de fonction connue (voir le tableau 1). Pour chaque élément génétique, fournir une citation où ces séquences fonctionnelles ont été décrites, isolées et caractérisées (les citations de bases de données publiquement accessibles sont acceptables) et indiquer :
    • 1.2.1.1 La portion et la taille de la séquence insérée
    • 1.2.1.2 L'emplacement, ordre et orientation dans le vecteur.
    • 1.2.1.3 Sa fonction chez la plante.
    • 1.2.1.4 La source (le nom scientifique et commun, ou l'appellation commerciale, de l'organisme donneur).
    • 1.2.1.5 Si l'élément génétique est responsable d'une maladie ou de dommages chez des végétaux ou d'autres organismes, et s'il s'agit d'un produit toxique, allergène, pathogène ou irritant.
    • 1.2.1.6 Si l'organisme donneur est responsable de toute maladie ou dommage chez des végétaux ou d'autres organismes, et s'il produit des toxines, des allergènes ou des irritants, ou s'il est apparenté à des organismes qui en sont responsables.
    • 1.2.1.7 S'il existe des antécédents d'utilisation sécuritaire de l'organisme d'origine ou de ses éléments.
  • 1.2.2 Si une modification importante a été effectuée à la séquence d'acides aminés codée par les gènes exprimés chez la plante, donner la citation. Si la séquence d'acides aminés modifiée n'a pas été publiée, donner la séquence au complet en indiquant les modifications. Les modifications qui ne touchent que quelques acides aminés peuvent simplement être mentionnées sans donner la séquence au complet. Indiquer si les modifications sont connues et si elles devraient entraîner des changements dans les modifications post-traductionnelles, ou des sites essentiels à la structure et à la fonction du produit génique.
  • 1.2.3 Fournir une carte détaillée du vecteur (voir la figure 1), incluant l'emplacement des séquences décrites ci-dessus, qui sera suffisante à l'analyse des données à l'appui de la caractérisation de l'ADN, y compris au besoin, l'emplacement des sites de restriction ou des amorces utilisées pour l'ACP et les régions utilisées comme sondes.

2 Hérédité et stabilité des caractères introduits et fonctionnels chez la plante

• 2.1 Pour les végétaux qui sont à fertilité mâle, à fertilité femelle, ou les deux, fournir des données qui démontrent le mode de transmission héréditaire et la stabilité d'expression des nouveaux caractères transgéniques. Si le nouveau caractère ne peut être mesuré de façon directe par un biodosage, il peut se révéler nécessaire d'examiner directement l'hérédité de l'insert d'ADN, ainsi que l'expression de l'ARN.
• 2.2 Pour les végétaux qui sont stériles ou ceux pour lesquels il est difficile de produire des semences (comme les pommes de terre androstériles multipliées végétativement), fournir des données pour démontrer que le caractère transgénique se maintient et s'exprime de façon stable au cours de la multiplication végétative pendant un certain nombre de cycles de production de la culture en question.

3 Caractérisation de l'ADN inséré dans la plante

• 3.1 Pour toutes les régions codantes, fournir des données qui démontrent que des copies complètes ou partielles sont insérées dans les génomes de la plante. Les régions codantes peuvent inclure des constructions à sens tronquées, des séquences modifiées non traduites, des constructions antisens, et des constructions contenant des ribozymes, peu importe si la région codante est conçue pour s'exprimer ou devrait s'exprimer dans la plante transgénique ou non. Pour les soumissions faites au Canada, de l'information indiquant le nombre de copies insérées y compris les copies partielles peut être exigée; de même pour ce qui est des végétaux allopolyploïdes, de l'information sur le génome parental qui a reçu l'insertion peut être requise.
• 3.2 Pour les régions non codantes liées à l'expression de régions codantes :
  • 3.2.1 Les données devraient démontrer si les promoteurs d'expression végétale sont insérés intacts avec les régions codantes dont ils ont pour but de réguler l'expression.
  • 3.2.2 L'analyse de l'ADN peut s'avérer nécessaire pour les introns, les séquences de signaux peptidiques, les terminateurs et les activateurs de cassettes conçues pour l'expression chez les végétaux.
  • 3.2.3 L'analyse de l'ADN peut s'avérer nécessaire pour les promoteurs et d'autres régions de régulation liées à des cassettes conçues pour l'expression chez les bactéries.
• 3.3 Pour ce qui est des régions non codantes qui n'ont aucune fonction végétale connue et ne sont pas liées à l'expression de régions codantes :
  • 3.3.1 L'analyse de l'ADN peut être requise pour certaines séquences de fonction connue (p. ex., ori V et ori-322, bom, limites de l'ADN-T d'Agrobacterium et éléments transposables bactériens).
  • 3.3.2 L'analyse de l'ADN n'est pas requise pour toute séquence restante du squelette plasmidique.

4 Caractérisation et expression des protéines et de l'ARN 

• 4.1 Pour toutes les régions codantes complètes insérées, fournir des données qui démontrent si la protéine est ou n'est pas produite comme prévu dans les tissus appropriés, conformément aux séquences de régulation associées commandant son expression (p. ex., si le gène est inductible, déterminer si le gène s'exprime dans les tissus appropriés aux conditions d'induction). Pour les végétaux résistants aux virus où les transgènes sont issus d'un génome viral, en plus de l'analyse de la protéine transgénique, déterminer le niveau d'ARN transgénique dans les tissus, conformément aux régions de régulation associées commandant l'expression du transgène. Les exceptions suivantes s'appliquent également :
  • 4.1.1 Si la concentration protéique est inférieure aux limites de détection, les données sur l'ARN messager peuvent servir de remplacement.
  • 4.1.2 L'analyse protéique des produits de gènes utilisés seulement comme marqueurs de sélection peut ne pas être requise dans certaines circonstances (p. ex., lorsqu'il existe au moins une copie complète d'un gène marqueur de sélection et que l'expression efficace du gène marqueur est vérifiée par le processus utilisé lors de la sélection du tissu transformé).
  • 4.1.3 Pour ce qui est des végétaux modifiés de façon à exprimer un ARN messager non traduisible, des constructions à sens tronquées, des constructions antisens ou des constructions contenant des ribozymes, comme la fonction de ces constructions génétiques consiste précisément à modifier l'accumulation d'un ARN messager spécifique ou d'une protéine présents dans la plante transgénique, fournir des données sur le niveau de la protéine cible seulement (p. ex., la polygalacturonase indigène de la tomate serait la protéine cible de la polygalacturonase antisens pour parvenir à altérer le mûrissement de la tomate). Si les concentrations de la protéine cible sont inférieures aux limites de détection, déterminer les concentrations de l'ARN messager cible.
• 4.2 Lorsqu'un fragment d'une région codante conçue pour s'exprimer dans la plante est décelé, déterminer si une protéine hybride peut être produite et dans quels tissus elle peut être située.
• 4.3 La caractérisation de la protéine ou de l'ARN peut ne pas être nécessaire pour les fragments de construction génétique non conçue pour être fonctionnelle chez la plante (p. ex., fragments de gènes marqueurs de sélection commandés par des promoteurs bactériens).

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Tableau 1 : Exemple d'un tableau qui décrit les éléments d'ADN d'un vecteur

Résumé d'éléments d'ADN chez PV-STBT02
(tiré du tableau III.1 de la demande de l'APHIS no 94-257-01p)

Élément génétique	Taille1 (ko)	Fonction et source
BD	0.36	Fragment de restriction du plasmide pTiT37 contenant les 24 pb de la bordure droite (BD) de l'ADN-T de type nopaline, utilisé pour amorcer le transfert de l'ADN-T de la bactérie Agrobacterium tumefaciens au génome de la plante (Depicker et al., 1982).
E35S	0.62	Le promoteur du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) (Odell et al., 1985) avec la région activante dupliquée (Kay et al., 1987).
cryIIIA	1.8	Gène qui confère la résistance au doryphore de la pomme de terre (DPT). Le gène code une séquence d'acides aminés identique à celle de la protéine toxique pour le DPT (dite protéine de la bande 3 du Btt) trouvée chez Bacillus thuringiensis variété tenebrionis, tel que signalé par Perlak et al. (1993).
E9 3'	0.63	Une région 3' non traduite de la petite sous-unité de ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase du gène E9 (rbcS) chez le poi (Coruzzi et al., 1984), qui a pour fonction de terminer la transcription et de diriger la polyadénylation de l'ARN messager cryIIIA.
NOS 3'	0.26	Région 3' non traduite du gène de la nopaline synthase qui a pour fonction de terminer la transcription et de diriger la polyadénylation de l'ARNm du gène nptII (Depicker et al., 1982; Bevan et al., 1983).
nptII	0.79	Le gène isolé de Tn5 (Beck et al., 1982) qui code pour la néomycine phosphotransférase type II. L'expression de ce gène chez les cellules végétales confère de la résistance à la kanamycine et sert de marqueur de sélection pour la transformation (Fraley et al., 1983).
35S	0.32	Promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) (Gardner et al., 1981; Sanders et al., 1987).
LB	0.45	Un fragment de restriction du plasmide Ti de l'octopine, pTi15955, contenant les 24 pb de la limite gauche de l'ADN-T, a servi à terminer le transfert de l'ADN-T de la bactérie Agrobacterium tumefaciens au génome de la plante (Barker et al., 1983).
ori V	1.3	Segment comportant l'origine de la réplication de la souche Agrobacterium tumefaciens ABI provenant du plasmide RK2 à large spectre d'hôtes (Stalker et al., 1981).
ori-322/rop	1.8	Un segment de pBR322 qui assure l'origine de la réplication pour le maintien du plasmide PV-STBT02 chez E. coli, la réplication de la région de l'amorce (rop) et du site bom pour le transfert conjugationnel dans les cellules de Agrobacterium tumefaciens (Bolivar et al., 1977 ; Sutcliffe, 1978).
aad	0.93	Fragment isolé du transposon Tn7 contenant un gène de 0,79 kb codant l'enzyme streptomycine adénylyltransférase et permettant de sélectionner les bactéries sur un milieu contenant de la spectinomycine ou de la streptomycine (Fling et al., 1985).

^1.Les tailles sont approximatives.

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Figure 1 : Exemple d'une carte détaillée d'un vecteur plasmidique

Exemple d'une carte détaillée d'un vecteur plasmidique