T-4-119 - Lignes directrices sur les évaluations des microorganismes présents dans les engrais et les suppléments régis par la Loi sur les engrais

Septembre 1997

Introduction

Les présentes lignes directrices constituent une explication des renseignements utiles pour l'évaluation de l'innocuité des microorganismes dans les engrais et les suppléments dont la liste est donnée dans la Circulaire à la profession T-4-118 - Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des microorganismes dans les engrais et les suppléments visés par la Loi sur les engrais. Ce document renferme plus particulièrement :

• les définitions des éléments dont la liste figure à l'Annexe I de la Circulaire T-4-118;
• une description de l'utilité de ces renseignements pour l'évaluation de l'innocuité;
• des conseils sur l'élaboration de données.

Section I : Description du produit et utilisation(s) prévue(s)

1.1 Description du produit

Description générale

Une description générale du produit ou des matières devant faire l'objet de la recherche, le cas échéant, y compris des renseignements comme l'état physique (p. ex., granules, liquide, poudre), la couleur, l'apparence, etc.

Liste de tous les ingrédients et contaminants

Il s'agit simplement d'une liste de tous les ingrédients trouvés dans le produit final (vecteurs, adjuvants, agents de conservation, adhésifs et contaminants). On doit également y nommer toutes les matières étrangères qui pourraient se retrouver dans le produit.

Concentration de chaque ingrédient dans le produit final

Le nombre de cellules viables ou de propagules appartenant au genre et, lorsque ce renseignement est connu, à l'espèce de chaque ingrédient actif contenu dans le produit final, garanti en poids (p. ex., cellules souches ou spores par gramme, etc.). Les quantités d'ingrédients non biologiques en termes généraux (p. ex., 10 % de milieu de culture, 30 % de tourbe déchiquetée, etc.).

Fiches signalétiques de sécurité (FSS) des produits et (ou) ingrédients

Une fiche signalétique de sécurité est un bulletin technique qui contient des renseignements détaillés sur une substance ou un produit. Elle constitue une source fondamentale de renseignements pour se familiariser avec les spécifications des produits et elle peut pointer vers des éléments (p. ex., des contaminants possibles) qui pourraient nécessiter une étude plus attentive. Cette fiche devrait aussi fournir l'explication détaillée des précautions et des mesures de protection à prendre. Le Système d'information sur les matières dangereuses utilisées au travail (SIMDUT) donne les critères à employer pour rédiger une FSS.

Courte description de la fonction des ingrédients utilisés

La fonction de chaque ingrédient (p. ex., adhésif) ou des combinaisons de plusieurs ingrédients (p. ex., milieu de croissance à base de K₂HPO₄, de MgSO₄.7H₂O, de NaCl, de mannitol, d'extrait de levure), le cas échéant.

Aperçu du procédé de fabrication

On doit fournir un résumé des étapes de combinaison des ingrédients bruts pris un à un en vue de la fabrication du produit formulé final. Ce résumé devrait indiquer les points critiques du procédé et décrire les mesures en place pour s'assurer que rien à ce niveau n'amoindrira la qualité du produit final. Ces renseignements serviront de matériel de référence relatif à la pureté, à l'uniformité et à l'innocuité du produit.

Si l'on n'a pas établi de procédé de fabrication standard pour le produit (p. ex., pour certains produits destinés à la recherche), veuillez décrire comment le produit à analyser a été fabriqué (p. ex., culture de bactéries à 25°C dans un milieu de croissance le soir précédant la date de libération prévue, à une concentration de 1 x 10⁹ cellules souches CFU/ml; addition de 50 ml de culture à 500 g de tourbe stérilisée).

On juge très utile de faire suivre le texte d'un schéma du processus.

1.2 Produits destinés à la recherche

Renseignements sur le site d'essai

La description des renseignements relatifs aux sites d'essai comprend deux volets : identification et caractérisation.

• Identification : Donner l'emplacement géographique précis (c.-à-d. la description cadastrale officielle ou l'adresse postale complète, le cas échéant, et la superficie prise pour les essais (p. ex., x m sur y m).
• Caractérisation : Décrire les caractéristiques du site (p. ex., type de sol, quantité de nutriments, usages antérieurs, distance jusqu'à des nappes d'eau superficielle ou souterraine, etc.), comparer l'habitat naturel du microorganisme et le site d'essai, et décrire la cinétique probable de la croissance de cet organisme sur le site d'essai. L'historique du site (p. ex., les organismes ayant déjà fait l'objet d'analyses sur le site et la culture d'une espèce végétale quelconque pour réduire la teneur en nutriments du sol, comme le maïs pour réduire la teneur en azote du sol) doit également être décrit.

Protocole expérimental

Le protocole expérimental décrit la façon dont l'étude sera menée et comprend des renseignements comme la date du début et la durée de la recherche proposée, le concept expérimental (p. ex., traitement, nombre de répétitions, cultures à traiter), toute pratique culturale particulière (p. ex., travail répété du sol, désherbage à la main), etc.

Surveillance

Il est important de mesurer la présence et la concentration du microorganisme sur le site pendant le déroulement de la recherche. Par conséquent, il est utile d'indiquer où, quand et comment les échantillons seront prélevés, avant, pendant et (ou) après la période d'essai.

Fin des travaux

On doit décrire ici les méthodes utilisées pour l'élimination du matériel traité et des produits non utilisés pendant les essais et (ou) à la fin des travaux.

Précautions prises afin d'assurer l'innocuité pour les aliments, les travailleurs et l'environnement

Précautions qui seront prises pour réduire l'exposition de l'environnement, des personnes qui manipulent le produit, de la chaîne alimentaire et des consommateurs au microorganisme. Il peut s'agir de renseignements comme les méthodes d'emballage et de transport du microorganisme jusqu'au site et à partir du site, les méthodes pour réduire la dissémination après l'application, les méthodes pour limiter l'accès du public et l'exposition des tiers, les mesures et le matériel de protection personnelle pour ceux qui appliquent le produit, les moyens d'élimination, etc.).

Mesures d'urgence

On doit décrire les plans d'urgence à mettre en oeuvre en cas de libération accidentelle du microorganisme pendant l'application, ou dans l'éventualité où l'on constaterait des effets défavorables (ou autres) sur l'environnement pendant le déroulement de la recherche.

1.3 Produits destinés à l'enregistrement

Nom du produit

Le nom du produit tel qu'il apparaît sur l'étiquette.

Quantité unitaire/format de l'emballage

On doit indiquer de quelle manière et en quelles quantités le produit sera vendu (p. ex., quatre contenants de 2 l par boîte, sacs de 200 g, etc.).

Profil d'utilisation

On doit indiquer où, quand et comment le produit sera utilisé, en fournissant les renseignements suivants :

• les espèces végétales et les types de sol (le cas échéant) auxquels est destiné le produit;
• le fait que le produit sera utilisé pour des cultures destinées à la consommation humaine ou à la consommation animale;
• le fait que le produit sera utilisé à l'intérieur de locaux ou à l'air libre, placé en contenants ou non, etc.
• le mélange, si le produit est utilisé avec d'autres produits;
• la ou les doses d'emploi prévues;
• le moment, la fréquence et les méthodes d'application;
• les mesures de santé-sécurité préconisées;
• a distribution, le stockage et la manutention;
• les mesures d'urgence préconisées;
• les stratégies de réutilisation, de revente ou d'élimination du produit non utilisé.

Renseignements relatifs à l'exposition des utilisateurs

Les renseignements suivants ont trait au profil d'utilisation, mais portent plus particulièrement sur l'exposition des utilisateurs au produit et à ses ingrédients :

• la quantité de produit manipulée par les utilisateurs;
• la fréquence et la durée de manipulation;
• le fait que le produit soit dilué ou non avant l'utilisation;
• les mesures de sécurité recommandées pour ceux qui manipulent et utilisent le produit;
• les voies possibles d'exposition des utilisateurs et des tiers (peau, inhalation, etc.);
• toute étude démontrant l'exposition des utilisateurs au produit ou à l'un ou l'autre de ses ingrédients.

Marché cible

On doit décrire le marché auquel le produit est destiné (p. ex., consommation, horticulture commerciale, agriculture sur une grande échelle).

Étiquette identifiant le produit

L'étiquette du produit doit être conforme aux dispositions du Règlement sur les engrais. Elle peut être présentée sous forme dactylographiée et doit comporter l'énoncé des mesures de précaution à prendre, le cas échéant.

Durée de conservation

On doit indiquer pendant combien de temps un produit peut être stocké sans qu'il perde de sa qualité biologique ou chimique. Il ne suffit pas d'indiquer la période de conservation dans des conditions idéales; il faut aussi fournir une description des facteurs qui nuisent à la conservation, de la façon qu'on s'aperçoit que le produit arrive à expiration et des risques que cette expiration comporte. Prière de fournir des données confirmant la durée de conservation.

Section II : Identification et caractérisation du microorganisme

2.1 Identification du microorganisme d'origine naturelle ou parental

L'identification exacte du microorganisme est considérée comme un élément clé de l'évaluation de l'innocuité du fait qu'une identification erronée du microorganisme aurait pour effet d'invalider les conclusions tirées au sujet de ses effets sur l'être humain et l'environnement.

Nom du microorganisme du point de vue taxinomique

On doit identifier le microorganisme de la façon suivante (le cas échéant) : genre, espèce, variété, biovar, sous-espèce, souche et/ou type, ainsi que tout changement apporté à la nomenclature.

Critères et données démontrant l'identité

On doit donner les méthodes utilisées pour identifier et classer le microorganisme, ainsi que les données confirmant l'identification. Les méthodes doivent être fondées sur les meilleures techniques connues et faisant l'objet du meilleur consensus, pour le groupe précis d'organismes dont il est question.

Dans le cas des cultures pures, les renseignements fournis doivent indiquer le rapport entre le microorganisme utilisé et des organismes pathogènes. Dans le cas des cultures mixtes, il convient d'identifier chaque ingrédient microbien actif de la même manière que s'il s'agissait d'un microorganisme en culture pure.

Nom commun, le cas échéant

On doit donner tous les noms, abréviations ou acronymes employés, y compris ceux utilisés dans d'autres pays.

Antécédents de la souche

On doit indiquer l'origine de la culture (p. ex., isolat environnemental, isolat clinique, souchothèque) et l'historique de la souche pendant son développement (p. ex., méthodes de sélection, entretien). Si le microorganisme est un isolat environnemental, on doit décrire l'habitat et le lieu où il a été isolé (p. ex., rhizosphère de blé à Saskatoon, Saskatchewan). S'il provient d'une souchothèque, on doit fournir le nom, l'adresse et le numéro de téléphone de cette dernière, de même que le numéro d'acquisition. On doit présenter aussi tout rapport ou tout autre document portant sur les utilisations passées du microorganisme considéré, relatives à des pratiques agricoles ou autres.

2.2 Caractérisation des microorganismes

2.2.1 Microorganismes d'origine naturelle ou parentaux

Cette section décrit les renseignements nécessaires à la caractérisation biologique et écologique de base du ou des microorganismes contenus dans le produit, ou de ceux dont dérive un microorganisme génétiquement modifié. Les renseignements demandés devraient fournir la somme des connaissances nécessaires pour évaluer les effets que ces microorganismes peuvent avoir sur les personnes et sur l'environnement, ainsi que son devenir dans l'environnement.

A - Devenir dans l'environnement

Ce type de renseignements aide à comprendre quels facteurs agissent sur la présence à court ou à long terme du microorganisme dans l'environnement. Lorsque les facteurs contrôlant la survie et la propagation du microorganisme sont connus, il devient plus facile de prévoir celles qu'il aura en conditions d'emploi.

Besoins et caractéristiques des conditions de culture

On doit indiquer les conditions de culture et les propriétés physiologiques qui influent sur la persistance, la prolifération et la croissance du microorganisme. Il peut s'agir de la température, du pH, de la dépendance à l'égard des nutriments, des besoins en oxygène, des sources d'énergie, de la tolérance ou de la sensibilité aux agents antimicrobiens, de la sensibilité aux facteurs du milieu (p. ex., ensoleillement, dessèchement), etc.

Cycle vital

On doit énumérer les différentes formes que prend le microorganisme durant son cycle vital. Il est important de les connaître car elles peuvent varier quant à la persistance, à la prolifération ou à la dissémination. Il peut s'agir de formes symbiotiques, viables mais impossibles à obtenir en culture, de stades dormants, de production de spores, etc. On doit décrire l'importance de ces formes pour le devenir du microorganisme dans l'environnement lorsqu'elles sont utilisées comme il se doit (p. ex., persistance, dispersion, etc.).

Gamme d'hôtes

On doit indiquer les espèces devant servir d'hôtes au microorganisme, et toute autre espèce susceptible d'être affectée par le microorganisme.

Mode d'action

On doit décrire de quelle façon le microorganisme exerce ses effets sur les espèces hôtes, lorsqu'ils sont connus.

Distribution géographique et fréquence d'apparition

On doit préciser les autres habitats au Canada où le microorganisme est trouvé ou encore peut proliférer ou se disséminer, ainsi que la concentration naturelle du microorganisme dans ces habitats.

Études contrôlées sur le devenir dans l'environnement

Les données sur le devenir sont particulièrement utiles lorsque les données sur les effets montrent qu'il existe une vaste gamme d'hôtes ou des effets néfastes importants (p. ex., effets néfastes sur des végétaux ou des animaux, ou autres organismes non ciblés d'intérêt environnemental ou économique). Les données sur le devenir environnemental peuvent être tirées d'expériences bien conçues réalisées sur des microcosmes, ou des mésocosmes, ou d'autres essais contrôlés à long terme permettant d'étudier le devenir du microorganisme ou de le surveiller. Les essais sur le devenir environnemental peuvent comprendre, entre autres :

• des données sur la persistance, la prolifération et la dissémination du microorganisme dans différentes conditions et dans différents milieux (terre, eau salée, eau douce);
• la capacité du matériel génétique introduit dans un microorganisme modifié génétiquement de se transmettre à d'autres organismes ou de persister dans l'environnement.

Présence en association avec des plantes de consommation humaine ou animale

On doit indiquer toute culture vivrière ou fourragère sur laquelle le microorganisme se trouve à l'état naturel. De même, il convient de fournir tout renseignement ayant trait à toute étude contrôlée qu'on peut avoir effectuée concernant les résidus dans les aliments destinés à la consommation humaine et animale. Il s'agit ici des résidus du microorganisme en question et des résidus chimiques qui peuvent être associés au microorganisme ou au produit.

S'il y a possibilité que le microorganisme produise une toxine agissant sur les mammifères, celui-ci sera soumis aux mêmes exigences qu'un produit chimique en ce qui a trait aux résidus. Pour de plus amples informations concernant les études des résidus dans les produits destinés à l'alimentation humaine et animale, il faut consulter la Circulaire à la profession T-4-113 - Directives sur l'évaluation de l'innocuité des engrais et des suppléments, et sur les renseignements à fournir à l'appui de leur innocuité et le Supplément T-4-113 - Donnés exigées pour l'évaluation de l'innocuité des produits : notes explicatives. Les données sur les résidus serviront à estimer l'exposition des humains et des bestiaux à la toxine dans le régime alimentaire.

B - Effets sur la santé et l'environnement

Les renseignements relatifs aux effets sur la santé humaine et l'environnement ont pour but de déterminer le type et la gravité des risques sanitaires ou environnementaux (s'ils existent) que peut poser le(s) microorganisme(s).

Production de toxines

On doit énumérer toute toxine produite par le microorganisme et tout métabolite apparenté aux toxines produites par d'autres microorganismes. S'il existe d'autres génotoxines produites par des champignons ou des actinomycètes apparentés, on doit avoir recours à des techniques d'analyse sensibles et appropriées afin d'aider à la caractérisation du microorganisme de manière à déterminer si le microorganisme en question produit de telles génotoxines.

Nature et degré des effets néfastes pour la santé

On doit préciser la nature et le degré des effets néfastes, y compris une description des caractéristiques et de la gravité des effets comme l'infectivité, la toxicité, la génotoxicité, la pathogénicité, le potentiel d'irritation et de sensibilisation ou d'hypersensibilité, ainsi que la virulence pour l'être humain, d'autres animaux, des plantes ou des microorganismes. On doit aussi indiquer les facteurs prédisposants et toutes les données épidémiologiques connues. Lorsqu'aucun effet n'a été constaté, on doit indiquer les tests effectués pour vérifier qu'effectivement il n'y a pas d'effets néfastes (p. ex., indiquer les banques de données consultées ainsi que la durée de la recherche, la stratégie et les mots-clés utilisés pour la recherche documentaire).

Potentiel dermatophytique

Le microorganisme est-il dermatophytique? Est-il associé à un dermatophyte humain connu? Dans l'affirmative, on doit décrire la relation et son importance pour l'utilisation du produit comme il se doit.

Relation avec tout microorganisme apparenté ayant des effets néfastes

On doit indiquer la relation qui existe entre le microorganisme et tout autre microorganisme associé aux effets néfastes précités, de même que son importance pour l'utilisation du produit comme il se doit.

Études contrôlées des effets sur la santé

Les études en question doivent permettre d'identifier des caractéristiques comme :

• le pouvoir pathogène du microorganisme;
• l'infectivité du microorganisme et le cycle d'élimination du produit;
• les effets toxiques possibles du microorganisme et de ses sous-produits.
• Infectivité et toxicité

Infectivité et toxicité

On peut effectuer plusieurs types d'études contrôlées pour déterminer dans quelle mesure les microorganismes peuvent produire des toxines (toxicité) et causer des maladies (pathogénicité) ou des lésions en envahissant les tissus humains et en s'y multipliant (infectivité). Certaines de ces études se décrivent comme suit :

Infectivité et toxicité orales aiguës

Pour cette évaluation, on administre par voie orale, c'est-à-dire par gavage, une dose élevée unique de l'ingrédient actif (le microorganisme) à chaque animal. Ce test nous renseigne sur la toxicité relative d'une dose élevée unique reçue par voie orale et sur l'infectivité inhérente de l'organisme.

Infectivité et toxicité pulmonaires aiguës

Pour ce test, on administre par instillation intratrachéale (injection dans la trachée) une dose élevée unique de l'ingrédient actif, c'est-à-dire du microorganisme (méthode à utiliser de préférence). Les méthodes d'inhalation classiques peuvent aussi être acceptables s'il est démontré que l'exposition ainsi produite est suffisante. Cette évaluation nous renseigne sur la toxicité relative d'une dose élevée unique reçue par voie pulmonaire et sur l'infectivité inhérente de l'organisme.

Infectivité aiguë par voie intraveineuse

Ce test est réalisé surtout pour les bactéries et les virus. On injecte par voie intraveineuse une dose élevée unique de l'ingrédient actif, ou du microorganisme. Ce test nous renseigne sur les risques probables d'infection par l'exposition à une dose élevée unique de l'organisme lorsque la barrière cutanée est contournée. Il nous apporte aussi des indications sur l'infectivité inhérente de l'organisme.

Infectivité aiguë par voie intrapéritonéale

Ce test est réalisé uniquement pour les champignons et les protozoaires. Si les caractéristiques physiques du microorganisme autorisent l'administration par voie intraveineuse, il convient d'utiliser ce mode d'administration au lieu de la voie intrapéritonéale dans le cas des champignons et des protozoaires. On administre une dose élevée unique de l'ingrédient actif (du microorganisme) par injection intrapéritonéale (dans le péritoine, c.-à.-d. dans la cavité abdominale - méthode à utiliser de préférence). Ce test nous renseigne sur les risques probables d'infection par l'exposition à une dose élevée unique de l'organisme lorsque la barrière cutanée est contournée. Il nous apporte aussi des indications sur l'infectivité inhérente de l'organisme.

Toxicité cutanée aiguë

Pour ce, test on applique une dose élevée unique du produit à évaluer, pendant une période d'exposition de 24 h, sur environ 10 % de la surface corporelle de chaque animal. Le test nous renseigne sur la toxicité relative de l'application cutanée d'une dose unique du produit à évaluer.

Irritation cutanée

Les microorganismes, leurs sous-produits métaboliques ainsi que les contaminants et les divers ingrédients de la formulation peuvent tous avoir des propriétés irritantes pour la peau, ce qu'on détermine par une évaluation des propriétés irritantes pour la peau. Le protocole présenté dans les lignes directrices de l'OCDE est jugé satisfaisant pour évaluer l'irritation cutanée.

Hypersensibilité cutanée

Il faut fournir l'information recueillie sur tous les types de réaction d'hypersensibilité observés durant la production, l'évaluation et la fabrication. La déclaration doit comprendre certains renseignements, notamment une description du microorganisme et de la formulation, la fréquence, la durée et les voies d'exposition au produit, les observations cliniques (y compris le type de réaction observée) ainsi que tout autre renseignement pertinent.

Potentiel génotoxique

Les champignons produisent parfois des toxines ou des sous-produits métaboliques qui peuvent être génotoxiques. Toutefois, si la caractérisation donne à penser que le produit pourrait produire des génotoxines connues, il faut faire des analyses appropriées à l'aide de méthodes sensibles pour établir la présence ou l'absence de ces génotoxines.

Culture tissulaire (agents viraux seulement)

Cette technique permet d'obtenir des données sur la capacité d'un agent viral de causer une infection (patente, persistante, latente ou abortive), de se répliquer dans les organismes, de transformer des lignées de cellules de mammifères ou d'exercer un effet toxique chez celles-ci. Les résultats devraient être connus pour tous ces points à observer.

• Produit à tester : Il faut utiliser la forme la plus infectieuse du virus, c'est-à-dire la forme qui produit une infection optimale dans la culture cellulaire visée ou chez l'organisme hôte. Il faut titrer le virus en utilisant la méthode la plus sensible, et dans le système hôte le plus vulnérable (culture tissulaire ou organisme hôte).
• Lignées cellulaires : Aux fins du test, on recommande l'utilisation des lignées cellulaires suivantes : une lignée cellulaire d'origine humaine (lignée WI38); un type de cellule de première explantation (prépuce); une lignée continue issue de cellules de primate (cellules CV-1 de singe). Pour ce qui a trait aux tests de transformation, on recommande le système (SHE)/SA7 de cellules primaires d'embryon de hamster de Syrie. Il faut utiliser une autre lignée cellulaire afin d'évaluer les problèmes particuliers que peut présenter le microorganisme, et l'utilisation qu'on veut en faire. La source et la stabilité génétique de chaque lignée cellulaire doivent être décrites.
• Toxicité : Il faut tester chaque lignée cellulaire et indiquer l'efficacité de la mise en culture (survie des clones), laquelle sert de mesure de la toxicité.
• Transformation : Il faut évaluer le potentiel oncogène de l'agent viral à l'aide du système SHE/SA7. Il faut utiliser des témoins positifs et négatifs appropriés. La période d'observation des cultures cellulaires inoculées doit être de 21 jours. L'essai peut ne pas être utile si le test d'infectivité démontre de façon concluante que l'acide nucléique viral n'est pas persistant dans aucune des lignées cellulaires étudiées.

• Infectivité : Chaque lignée cellulaire doit être exposée à un grand nombre des formes les plus infectieuses du virus. La période d'observation des effets cytopathologiques après l'inoculation doit être de 21 jours. Il faut déterminer le titre du virus, de l'antigène viral et de l'acide nucléique dans les cellules les jours 1, 2, 5, 7, 14 et 21. Il faut rechercher dans les liquides de cultures cellulaires la présence de virus infectieux par exposition à un hôte sensible. Il faut employer des témoins qui conviennent (comme un virus à l'étude inactivé comme témoin négatif et une lignée cellulaire permissive ou un organisme hôte comme témoin positif).
  • La technique ELISA (méthode immuno-enzymatique); la méthode immuno-enzymatique sur filtre de nitrocellulose; la méthode du transfert de Western (protéine) ou autres méthodes sensibles similaires sont recommandées pour la détection des protéines.
  • La méthode d'hybridation sur tache; l'hybridation in situ, l'hybridation de Southern et d'autres méthodes sensibles sont recommandées pour la mise en évidence des acides nucléiques.

Nota : On doit indiquer la sensibilité et les limites de chaque méthode et décrire tout effet cytopathologique ou réplication virale observée dans les cultures tissulaires.

Effets possibles sur l'environnement

Il est question ici des effets possibles sur le milieu de l'utilisation délibérée du microorganisme. Voici une liste partielle des renseignements requis :

• la croissance accrue ou réduite des plantes cibles et non cibles;
• les effets néfastes sur la santé des plantes et des animaux cibles et non cibles;
• l'implantation d'inoculants microbiens compétitifs, mais de faible rendement;
• la spécificité de l'hôte
• la modification de la communauté microbienne (du point de vue de la structure ou de la fonction);
• les effets sur les processus naturels (p. ex., cycles des minéraux);
• la résistance accrue à des conditions environnementales défavorables (p. ex., tolérance au froid ou à une salinité élevée);
• la résistance accrue relativement aux traits sélectionnables (p. ex., résistance à des antibiotiques, résistance à des métaux lourds);
• les effets des traits introduits intentionnellement sur l'un ou l'autre des éléments précédents;
• les effets sur la biodiversité (p. ex., distance jusqu'à des secteurs peuplés ou protégés, détermination des espèces menacées ou en danger de disparition et effets sur celles-ci, ou impacts sur toute ressource biologique d'importance économique ou sociale située dans le secteur d'utilisation prévue).

Études contrôlées des effets environnementaux

Des tests d'écotoxicologie sont utilisés pour établir l'infectivité, la toxicité et la pathogénicité éventuelles d'un microorganisme pour des organismes non visés (p. ex., des végétaux, des animaux, des invertébrés, des microorganismes, des organismes aquatiques).

Nota : Certains des renseignements décrivant les effets possibles sur la santé des humains et des mammifères (voir ci-dessus) peuvent également être importants pour la protection de l'environnement et justifier une répétition ou une référence dans la présente section.

Tests sur une espèce unique

Les tests sur une espèce unique sont recommandés dans les cas suivants :

• une espèce particulière non ciblée d'intérêt économique, une espèce en danger ou une espèce jugée importante et qui se trouve dans la région où l'on prévoit utiliser le produit;
• le microorganisme est apparenté à un autre microorganisme qui, lui, cause des effets néfastes sur la santé des végétaux ou des animaux (dans ce cas, le choix d'un microorganisme approprié à tester dépendra de l'hôte sensible du microorganisme apparenté);
• le microorganisme pourrait avoir un effet sur l'organisme cible.

Études des effets sur l'écosystème

Ce type d'études sert à déterminer les effets éventuels non pas sur des organismes particuliers directement, mais sur l'écosystème lui-même. Cela est particulièrement utile lorsqu'on ne peut pas mesurer les effets sur chaque organisme, ou lorsqu'il convient de considérer « la situation générale » qui comprend les interactions entre chaque organisme, entre les différents types d'organismes et entre les niveaux trophiques. Les données peuvent être tirées d'expériences sur des microcosmes ou des mésocosmes destinées à mesurer :

• les modifications de la structure de l'écosystème (p. ex., la modification de l'abondance relative de divers organismes ou catégories d'organismes comme les bactéries dénitrifiantes);

• les effets sur le rôle de l'écosystème (p. ex., les effets sur la remise en circulation des nutriments du sol ou sur la production primaire).

2.2.2 Microorganismes modifiés à l'aide de méthodes classiques¹

Méthode de modification

On doit indiquer la ou les techniques utilisées pour modifier le microorganisme (p. ex., mutagénèse, conjugaison, transformation, transduction).

Traits sélectionnés

On doit décrire les traits ou caractéristiques exprimés par le microorganisme génétiquement modifié.

Mode d'action du trait (s'il est connu)

On doit préciser de quelle manière le trait ou la caractéristique exprimés modifient l'organisme cible.

¹ On doit décrire la modification d'un microorganisme parental. Dans le cas des microorganismes modifiés génétiquement, le microorganisme hôte doit être identifié et caractérisé comme on l'explique aux sections 2.12.1 et 2.2.1. Le degré de précision nécessaire pour décrire la modification génétique obtenue dépend de la méthode utilisée pour produire cette modification. Dans les cas où il n'est pas (raisonnablement) possible de déterminer quelles modifications précises ont été apportées au génome du microorganisme, une description des caractères modifiés et de leur mode d'action est nécessaire. Toutefois, lorsqu'on connaît la modification précise qui a été apportée au génome du microorganisme, on doit indiquer l'origine et la fonction du matériel génétique introduit ainsi que la méthode utilisée pour modifier le microorganisme hôte.

2.2.3 Microorganismes modifiés à l'aide de techniques de biologie moléculaire

A - Origine et fonction du matériel génétique introduit

Identification du microorganisme donneur du point de vue taxinomique

On doit identifier le microorganisme d'où provient le matériel génétique introduit. Prière de fournir les renseignements suivants (le cas échéant) : genre, espèce, variété, biovar, sous-espèce, souche et (ou) type.

Capacité de transfert de matériel génétique

On doit décrire les éléments génétiques présents sur le matériel génétique introduit, qui facilitent le transfert de gènes. Quant aux éléments génétiques associés à la capacité de transfert de gènes, on doit indiquer l'origine de ces éléments (c.-à-d. l'organisme où l'ADN a été isolé pour la première fois, d'après la recherche documentaire). On doit décrire la capacité du microorganisme hôte de transférer de son matériel génétique à d'autres organismes (p. ex., par transformation, conjugaison, transduction et transfection) et souligner la présence de tout élément génétique susceptible d'aider au transfert de gènes (p. ex., éléments transposables, séquences d'insertion, plasmides mobilisables, sensibilité aux phages).

Matériel génétique, gènes et produits géniques insérés dans un microorganisme hôte

On doit donner le nom du gène, du trait ou du caractère codé par le gène, ainsi que le nombre de copies du gène inséré.

Promoteurs et leurs sources

On doit nommer le promoteur qui contrôle l'expression du gène inséré ainsi que sa source originale. Lorsque les manipulations génétiques comprennent un réarrangement et que le gène n'est pas inactivé, il se peut que la source originale du promoteur soit le microorganisme hôte.

Terminateurs et leurs sources

On doit nommer le terminateur qui contrôle la terminaison de la transcription du gène inséré ainsi que sa source originale. Lorsque les manipulations génétiques comprennent un réarrangement et que le gène n'est pas inactivé, il se peut que la source originale du terminateur soit le microorganisme hôte.

Autres séquences génétiques

On doit indiquer le matériel génétique inséré dans le microorganisme hôte, qui ne code pas pour la fonction qu'on veut transférer (p. ex., gènes marqueurs, phases ouvertes non codantes, séquences d'ADN non identifiées).

Résistance aux antibiotiques d'importance clinique ou vétérinaire, et répercussions possibles

On doit identifier toute résistance aux antibiotiques conférée au microorganisme parental par l'introduction de matériel génétique.

B - Construction de la souche

Schéma du processus expliquant en détail la construction de la souche

On doit présenter un schéma où sont détaillés les noms du donneur, de l'hôte et du vecteur (ADN) ainsi que les différentes étapes, présentées dans l'ordre de leur développement, qui conduisent à la construction du microorganisme modifié sous sa forme finale (se reporter à l'Annexe I);

Manipulations nécessaires à la construction du microorganisme modifié

On doit fournir la description des manipulations requises pour fabriquer le microorganisme modifié sous sa forme finale. On doit fournir assez de détails pour qu'un spécialiste puisse reprendre la démarche. La description doit correspondre aux étapes mentionnées dans le schéma du processus expliquant en détail la construction de la souche (point ci-dessus); elle doit aussi fournir certains renseignements descriptifs tels que :

• une caractérisation plus complète du ou des vecteurs utilisés au cours des manipulations, notamment le nom, le type (clonage, expression, navette) et la source du vecteur ou de ses constituants, groupes de mobilisation et d'incompatibilité et expression génétique dans le vecteur;
• les méthodes utilisées pour isoler et reconnaître le matériel génétique à transférer dans le microorganisme hôte (on peut faire référence aux méthodes standard de clonage plutôt que de les décrire en détail);
• la description des sites intra- ou extrachromosomiques du gène qui fait l'objet de notre attention, ou des sites de délétion ou de réarrangement (p. ex., mutagénèse dirigée);
• les méthodes et les résultats pour confirmer l'insertion, la délétion et/ou le réarrangement (p. ex., séquence nucléotidique contiguë à la région d'insertion, données sur les séquences significatives précédant et suivant la délétion ou le réarrangement);
• les méthodes de sélection des produits génétiques intermédiaires.

Schéma général du produit génétique final

On doit présenter un schéma donnant les caractéristiques essentielles du produit génétique final (voir Annexe I);

Légende accompagnant le schéma général du produit génétique final

On doit donner une courte description, sous forme de légende, de tous les aspects des détails contenus dans le schéma général du produit génétique final.

2.2.4 Microorganismes modifiés

On doit décrire quelle est l'expression du matériel génétique introduit de manière à montrer plus complètement les effets possibles de la modification opérée sur l'innocuité du microorganisme hôte pour la santé humaine et l'environnement.

Modification des caractéristiques microbiennes du microorganisme parental

On doit indiquer toute différence entre les caractéristiques du microorganisme parental et du microorganisme modifié génétiquement, qui est attribuable à la modification du microorganisme parental. On doit accorder une attention particulière à la description des effets possibles de l'expression génétique sur l'environnement ou la santé humaine (par l'exposition des aliments, des utilisateurs ou des tiers), notamment :

• aux traits qui pourraient conférer au microorganisme modifié un avantage ou un désavantage écologique (p. ex., besoins du point de vue de la culture, facteurs influant sur la gamme d'hôtes, persistance, prolifération, croissance ou dissémination);
• à l'infectivité, à la toxicité, à la pathogénécité ou à la virulence du microorganisme;
• aux effets que les gènes marqueurs conférant une résistance aux antibiotiques et (ou) aux éléments lourds peuvent avoir sur la santé et l'environnement (si des antibiotiques importants sur le plan clinique ou vétérinaire sont utilisés, on doit en justifier l'utilisation).
• Modes d'expression des gènes introduits

On doit indiquer comment le matériel génétique introduit est exprimé chez le microorganisme génétiquement modifié (p. ex., est-il inductible ou constitutif? S'il est inductible, le mécanisme est-il chimique ou développemental?). Il s'agit d'examiner l'importance de l'expression en regard du mode d'utilisation du produit et des effets sur l'environnement.

Expression ou suppression non intentionnelle de gènes chez le microorganisme modifié

On doit évaluer le potentiel d'expression ou de suppression non intentionnelle de gènes chez le microorganisme modifié par suite de la manipulation génétique (p. ex., effets possibles de séquences non identifiées d'ADN ou de phases ouvertes non fonctionnelles).

Stabilité génétique

On doit évaluer le potentiel de réversion redonnant le génotype et le phénotype parentaux (p. ex., taux de réversion et (ou) de mutation, taux de perte d'ADN chromosomique ou extrachromosomique, taux de transfert des gènes).

Devenir des produits génétiques codés par les gènes introduits

On doit tenter d'indiquer ce qu'il advient du produit codé par les gènes introduits (p. ex., produit intact/détruit/dégradé dans l'environnement, produit faisant partie des chaînes alimentaires pour les êtres humains ou la faune).

2.3 Détection et quantification du microorganisme d'origine naturelle ou modifié

Tests de détection du microorganisme

On doit indiquer les méthodes pour détecter et quantifier le microorganisme dans des échantillons de produits ou dans le milieu. Il faut indiquer la sensibilité, la spécificité, la fiabilité, le côté pratique et les limites du système de détection de ces méthodes, qui doivent aussi permettre à un tiers d'identifier et de compter le ou les microorganismes. Lorsque le microorganisme a été génétiquement modifié, cette méthode doit permettre de sélectionner le microorganisme modifié en présence du microorganisme parental non modifié.

Toutes les études réalisées doivent respecter les principes des Bonnes pratiques de laboratoire (BPL). Les principes des BPL de l'EPA des États-Unis (Volume 48, n^o 230, 29 novembre 1983) et de l'OCDE (Annexe 2 de la Décision du Conseil C[81])30 - document final) peuvent servir de lignes directrices.

Annexe I - Schéma du processus de construction génétique et schéma générale du produit génétique final

Ci-après, on explique comment préparer le schéma du processus de construction et le schéma du produit génétique final en précisant les renseignements à fournir pour que la description de la forme finale du microorganisme modifié soit complète.

Schéma du processus de construction génétique

En général, le microorganisme obtenu comme produit final a été modifié par l'insertion d'une séquence d'acide nucléique sur un chromosome; la modification peut toutefois avoir été obtenue par d'autres moyens tels que des délétions, des réarrangements génomiques, des plasmides recombinants extrachromosomiques, etc. Le but du schéma du processus est d'illustrer l'enchaînement des différentes étapes réalisées pour obtenir le produit final, un microorganisme modifié. Il doit renseigner sur certains points, notamment sur tous les plasmides et les vecteurs utilisés (avec les noms importants, l'emplacement des sites d'endonucléase de restriction, les gènes marqueurs, etc.), les manipulations génétiques (p. ex. le clonage, la purification, la fixation des linkers, la ligation, la conjugaison, la recombinaison homologue, etc.).

Schéma général du produit génétique final

Ce schéma doit renseigner sur la nature et l'origine des ADN donneur, receveur et vecteur qu'on retrouve dans le microorganisme modifié final. Il doit comporter des informations telles que l'identité et la taille du produit génétique final, les gènes codants les plus importants, avec leur provenance, le sens de la transcription, les séquences génétiques d'intérêt (p. ex. les promoteurs, les codons de terminaison, les codons régulateurs et ainsi de suite, avec leur provenance), les cadres ouverts de lecture additionnels, avec leur provenance, l'emplacement des sites d'endonucléase de restriction importants, les marqueurs et toutes les autres séquences d'acide nucléique d'intérêt (p. ex. celles qui interviennent dans la réplication, l'entretien et le transfert). Une légende doit compléter le tout. Les schémas de produits extrachromosomiques finals doivent fournir des renseignements aussi détaillés en plus de précisions sur les séquences bordant le site d'insertion chromosomique.

Information supplémentaire

Agence canadienne d'inspection des aliments
Direction de la protection des végétaux et biosécurité
Division d'intrants des cultures
Section des engrais
59 promenade Camelot
Ottawa, Ontario
K1A 0Y9
Canada
Téléphone : 613-773-7189
Télécopieur : 613-773-7163