Sélection de la langue

Recherche

T-4- 126 – Identification et classification taxonomique des micro-organismes présentés pour usage comme suppléments en vertu de la Loi sur les engrais

1. Objectif

L'objectif du présent document est de fournir des directives en ce qui a trait aux méthodologies et aux techniques scientifiques acceptable pour l'identification des micro-organismes utilisés comme ingrédients actifs dans les suppléments microbiens.

Le présent document porte principalement sur l'identification taxonomique des cultures pures de micro-organismes appartenant aux règnes des 1) bactéries, 2) archéobactéries et 3) champignons, qu'ils soient d'origine naturelle ou modifiés par manipulation génétique. Il comprend également des directives sur les méthodes d'identification relatives aux consortiums microbiens.

2. Identification microbienne

La connaissance des caractéristiques phénotypiques, génotypiques et biologiques d'un micro-organisme est essentielle pour le différencier des organismes pathogènes et toxigènes apparentés ou des autres organismes nuisibles pour la santé végétale, animale et humaine et pour l'environnement. Par conséquent, une identification précise du ou des micro-organismes actifs constitue une composante fondamentale de toutes les évaluations d'innocuité des suppléments microbiens réglementés en vertu de la Loi sur les engrais. D'ailleurs, les conclusions relatives à l'innocuité du produit ou à ses répercussions sur la santé humaine ou sur l'environnement sont valides seulement si le ou les micro-organismes actifs sont identifiés correctement.

Les directives générales à l'égard des propriétés dangereuses des micro-organismes reconnus pour être des pathogènes humains ou animaux se trouvent sur le site Web du Centre de la biosécurité de l'Agence de la santé publique du Canada et dans ePATHogène – la base de données sur les groupes de risque de l'Agence de la santé publique du Canada.

Approche polyphasique de l'identification microbienne

Le choix de la ou des méthodes utilisées pour l'identification microbienne dépend du type et de la nature du micro-organisme. La ou les méthodes choisies doivent être bien décrites dans la littérature scientifique et conformes à celles qui sont actuellement utilisées dans le domaine de l'identification et de la classification taxonomique microbienne. Ces méthodes doivent aussi permettre l'identification des organismes au niveau du genre, des espèces et, si possible, de la souche. La robustesse, la précision et la validité des méthodologies utilisées pour identifier le micro-organisme constituent des caractéristiques cruciales dans l'évaluation de l'innocuité du produit.

Le choix des méthodes d'identification microbienne est laissé à la discrétion du requérant. Toutefois, l'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA) recommande que les demandeurs intègrent l'analyse microbiologique et phénotypique classique ainsi que des outils moléculaires pour s'assurer de l'exactitude de l'identification. Les forces et les faiblesses des diverses méthodes d'identification doivent être prises en considération, de sorte que les méthodes choisies se complètent les unes les autres, pour en arriver à une identification concluante et définitive du micro-organisme et pour permettre une différenciation claire de l'organisme par rapport aux autres espèces et souches pathogènes ou toxigènes étroitement apparentées. Les méthodes couramment utilisées pour identifier et justifier la classification taxonomique des micro-organismes sont résumées ci-dessous.

2.1 Analyse phénotypique

Les méthodes phénotypiques conviennent aux micro-organismes qui peuvent croître en culture pure sur un milieu artificiel, et dont les paramètres de croissance ainsi que les profils physiologiques et biochimiques sont bien établis.

L'expression des phénotypes microbiens est hautement dépendante des variables environnementales (par exemple pH de la culture, température, milieu de culture sélectif ou non sélectif, épuisement des éléments nutritifs, présence de facteurs de stress, etc.) et, par conséquent, peut introduire des incohérences dans le processus d'identification. Les méthodes phénotypiques sont acceptables seulement si les critères de réponse suffisent à identifier le micro-organisme avec un haut niveau de confiance et à le distinguer des organismes phylogénétiquement et étroitement apparentés qui posent potentiellement des problèmes d'innocuité. En outre, l'applicabilité de la méthode repose sur la robustesse des renseignements retrouvés dans les bases de données de référence. Pour être acceptée, l'analyse phénotypique doit être appuyée par des données provenant d'autres méthodes dans le cadre de l'approche polyphasique.

2.1.1 Caractères morphologiques

La morphologie de la colonie et des cellules permet d'obtenir une identification initiale relativement à un micro-organisme. Cela s'effectue par des méthodes simples d'isolation et de culture du micro-organisme et par l'observation visuelle subséquente au moyen du microscope. Les propriétés morphologiques comprennent:

  1. la forme
  2. la taille
  3. les caractéristiques de la surface et la pigmentation
  4. les caractéristiques de la paroi cellulaire (procédé de coloration de Gram)
  5. les caractéristiques de sporulation
  6. les mécanismes de motilité
  7. les autres inclusions cellulaires et caractéristiques ultrastructurales

2.1.2 Caractéristiques biochimiques, physiologiques et métaboliques

L'évaluation phénotypique comprend l'étude du profil biochimique et des propriétés métaboliques d'un micro-organisme par l'entremise de tests sur ses conditions de croissance, sur ses activités enzymatiques et sur la composition de ses cellules en acide gras.

Les tests biochimiques utilisent des milieux de croissance, des éléments nutritifs, des produits chimiques ou des conditions de croissance particulières afin d'obtenir une réponse biochimique observable et mesurable du micro-organisme, permettant ainsi son identification et sa caractérisation. Ces tests comprennent: l'utilisation de sources de carbone et d'azote, différentes conditions de croissance (anaérobie ou aérobie; température optimale et gamme de température, pH optimal et gamme de pH), des conditions osmotiques préférentielles, la production de produits de fermentation, la production d'enzymes, la production de composés antimicrobiens, de même que la sensibilité aux inhibiteurs métaboliques et aux antibiotiques. Parmi les tests reconnus, on retrouve les tests au rouge de phénol et carbohydrate , les tests de catalase et d'oxydase, les tests d'oxydation/fermentation, les tests au rouge de méthyle, les tests de Voges-Proskauer, la réduction des nitrates, l'hydrolyse de l'amidon, l'hydrolyse du tryptophane, la production de sulfure d'hydrogène, l'utilisation du citrate, les réactions du petit-lait tournesolé, etc. Plusieurs systèmes commerciaux miniaturisés et automatisés sont actuellement offerts et sont assortis de procédures de contrôle de la qualité bien définies qui permettent l'identification rapide des micro-organismes.

2.1.3 Analyse de la composition en esters méthyliques d'acide gras (analyse EMAG)

On peut identifier les micro-organismes en analysant les profils d'acides gras de cellules entières ou de membranes cellulaires par la chromatographie en phase gazeuse ou la spectrométrie de masse. Les profils d'acides gras (type, contenu, proportion et variation) sont comparés à ceux des organismes connus pour identifier le genre et l'espèce.

2.2 Méthodes moléculaires

La biologie moléculaire apporte un ensemble de nouveaux outils puissants. Ces méthodes ont grandement amélioré la rapidité de détecter, d'identifier et de classifier rapidement les micro-organismes en plus d'établir la relation taxonomique parmi les genres et les espèces apparentés . L'identification, par les méthodes moléculaires, repose sur la comparaison de séquences d'acides nucléiques (ADN, ARN) ou de profils protéiques d'un micro-organisme avec les données documentées d'organismes connus. Les méthodes moléculaires sont considérées comme suffisamment sensibles pour permettre une détection à des concentrations faibles de micro-organismes viables ou non viables autant dans les échantillons de cultures pures et que ceux de cultures complexes (par exemple, terre, tourbe, eau, etc.).

2.2.1 Méthodes génotypiques basées sur des modèles et du séquençage

Dans les techniques faisant appel au modèle, une série de fragments provenant de l'ADN chromosomique d'un organisme sont générés. Les fragments générés sont alors séparés en fonction de leur taille pour créer un profil, ou une empreinte génétique unique à cet organisme et aux organismes très apparentés. Ces renseignements sont compilés pour créer une base de données d'empreintes génétiques des organismes connus, à laquelle le profil du micro-organisme testé peut être comparé. Selon la similarité entre les profils des deux organismes, ils seront considérés comme très apparentés ou pas du tout apparentés. Voici quelques exemples de techniques faisant appel au modèle:

Méthode Technologie
PCR à éléments répétitifs (réaction en chaîne de la polymérase) Les amorces ciblent des éléments répétitifs spécifiques distribués dans les chromosomes de façon aléatoire.
Polymorphisme de longueur des fragments amplifiés (AFLP) L'ADN chromosomique est digéré par des enzymes de restriction, suivi d'une PCR à l'aide d'adaptateurs couplés aux sites de restriction.
Profilage ribosomique L'ADN chromosomique est digéré par des enzymes de restriction, suivi d'une recherche pour les gènes ribosomiques.
Amplification aléatoire de l'ADN polymorphe De courts segments de l'ADN chromosomique sont amplifiés de façon aléatoire par un ensemble d'amorces courtes arbitraires.
Électrophorèse sur gel en champ pulsé Des enzymes rares de restriction de coupe sont utilisées pour couper l'ADN chromosomique en gros fragments, et les fragments sont déterminés.
PCR multiplex Des gènes de diagnostic sont ciblés par les amorces de la PCR.

Dans les techniques faisant appel au séquençage, la séquence d'un segment particulier d'ADN est déterminée. Le degré de similarité, ou la concordance, entre une séquence d'ADN provenant d'une base de données et une séquence testée indique dans quelle mesure les deux organismes sont apparentés. Des algorithmes informatisés sont ensuite utilisés pour comparer plusieurs séquences les unes aux autres et établir un arbre phylogénétique à partir des résultats. Voici quelques exemples de techniques faisant appel au séquençage :

Méthode Technologie
Séquençage du gène ribosomique en petites sous‑unités (ARNr 16s) Les amorces conservées sont utilisées pour amplifier puis séquencer l' ARNr, les séquences sont ensuite comparées à une base de données pour l'identification du genre et de l'espèce des microorganismes.
Analyse du séquençage du gène de l'ARNr de l'espaceur transcrit interne (ITS) Des amorces spécifiques sont utilisées pour amplifier, puis séquencer les espaceurs transcrits internes entre les locus des gènes d'ARNr 16S et 23S. Les séquences sont ensuite comparées à une base de données pour l'identification des micro-organismes au niveau des espèces et des sous-espèces.
Typage génomique multi‑locus (MLST) et analyse génomique multi‑locus (MLSA) Séquençage de l'ADN d'un sous-ensemble particulier de gènes conservés et semi-conservés pour une espèce donnée, suivi d'une comparaison des séquences concaténées.

Les techniques d'empreinte génétique et les méthodes faisant appel au séquençage ont toutes deux leurs forces et leurs faiblesses. Les méthodes faisant appel au séquençage, tel que l'analyse du gène d'ARNr 16s, se sont avérées efficaces quant à l'établissement des relations phylogénétiques globales parmi les bactéries au niveau du genre, de la famille, de l'ordre et du phylum, tandis que les méthodes ayant recours à l'empreinte génétique sont bonnes pour distinguer les relations au niveau de la souche ou de l'espèce, mais sont moins fiables pour établir l'interdépendance au-dessus du niveau de l'espèce ou du genre. Compte tenu de ces limites, il est important de valider les résultats des méthodes d'identification génotypique microbienne avec des données provenant d'autres sources (par exemple, des analyses morphologiques et/ou phénotypiques).

L'identification génotypique fiable requiert des bases de données contenant des renseignements de séquences complètes et exactes d'un grand nombre de taxons. Les bases de données de séquences génétiques qui sont utilisées couramment comprennent:

  1. GenBank®
  2. Ribosomal Database Project (RDP) (en anglais seulement)
  3. Europe's collection of nucleotide sequence data (EMBL) (en anglais seulement)
  4. Universal Protein Resource (UniProt) (en anglais seulement)

Les requérants ne sont pas limités à l'utilisation des documents de références énumérés ci-dessus; ils sont mentionnés seulement à titre indicatif.

2.2.2 Méthodes basées sur les techniques protéomiques

Les méthodes qui déterminent l'activité d'enzymes particuliers, comme la catalase ou l'oxydase, ou les fonctions métaboliques, telles que la capacité de dégrader le lactose, ont longtemps été utilisées comme méthodes de base pour l'identification bactérienne. Les outils protéomiques offrent un excellent complément aux techniques classiques fondées sur la génomique ou la microbiologie en ce qui concerne la classification, l'identification, et la caractérisation phénotypique des bactéries. Les techniques protéomiques prédominantes qui ont été utilisées pour l'identification et la caractérisation bactérienne comprennent les suivantes :

  1. la désorption-ionisation par impact laser assistée par matrice spectrométrie à temps de vol (technologie MALDI-TOF-MS)
  2. la spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation (technologie ESI-MS)
  3. la désorption-ionisation laser assistée par surface (technologie SELDI)
  4. la spectrométrie de masse
  5. l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide au dodécyl-sulfate de sodium (SDS-PAGE) à une ou deux dimensions
  6. une combinaison de spectrométrie de masse, d'électrophorèse sur gel, et de bio-informatiques, etc.

Les méthodes sérologiques, comme le transfert de type Western, l'immunoprécipitation (IP) et la méthode immunoenzymatique ELISA (ELISA), utilisent des anticorps pour déceler des protéines précises qui sont uniques ou caractéristiques à un micro-organisme . L'applicabilité des méthodes sérologiques dépend de la disponibilité, de la sensibilité et de la spécificité des anticorps utilisés.

2.3 Séquençage du génome entier

Le séquençage de génome entier est une méthode exhaustive pour analyser des génomes entiers. La capacité de produire un grand nombre de données avec les séquenceurs d'aujourd'hui fait du séquençage de génome entier un puissant outil pour la recherche en génomique. Le séquençage de génome entier permet de voir le génome entier base par base en haute résolution, capture les petites et les grandes variantes et fournit de grandes quantités de données en peu de temps. Cette approche permet d'étudier tous les gènes à partir d'une seule culture d'organisme, offrant ainsi une analyse complète du génome microbien, y compris l'identification précise de la souche. Le séquençage de génome entier peut détecter des variantes nucléotidiques uniques, des insertions et des suppressions, des changements au nombre de copies et de grandes variantes structurelles.

Le séquençage de génome entier peut être considéré comme l'outil idéal dans la caractérisation de souche. En conséquence, les résultats du séquençage de génome entier seront acceptés à eux seuls pour corroborer l'identification microbienne dans le cadre d'une demande d'enregistrement en vertu de la Loi sur les engrais.

3. Méthodes d'identification des consortiums microbiens

Un consortium microbien est un groupe complexe de micro-organismes, dont la composition demeure inchangée sans autre manipulation, provenant d'un seul environnement naturel . L'ACIA recommande l'une des approches suivantes pour l'identification taxonomique des consortiums microbiens :

3.1 Identification de toutes les espèces au moyen d'une approche polyphasique

Il s'agit de l'approche qui devrait être choisie, dans la mesure du possible. Il est possible d'utiliser une combinaison de méthodes moléculaires, biochimiques et microbiologiques.

3.2 Identification des groupements taxonomiques et dépistage des composantes microbiennes dangereuses

Lorsqu'il est impossible de désigner avec précision le groupe taxonomique, il est possible de recourir à l'identification au niveau du genre (et peut-être de la famille) pour décrire les principaux constituants dans un consortium. Par exemple, le clonage et le séquençage du gène ARNr 16S peuvent servir à la détection des unités taxonomiques opérationnelles (UTO) attribuées à des genres ou à des familles spécifiques de micro-organismes. La disponibilité limitée des isolats environnementaux dans les bases de données ou la faible concentration des constituants au sein du consortium peut être un facteur limitant l'identification des constituants. Cette approche ou une autre approche similaire peut servir de moyen pour identifier les principaux genres et les principales familles des micro-organismes d'un consortium.

Lorsque les groupements taxonomiques sont identifiés, le consortium doit être soumis à un examen de dépistage à l'égard des espèces dangereuses pertinentes au produit en question. Les indicateurs liés au type de produit et à la source doivent être choisis par le requérant. Par exemple, un produit pourrait être contrôlé relativement aux espèces pathogènes pour les humains tels que Salmonella Sp., Listeria Monocytogenes, Vibro Sp., Campylobacter Sp., Clostridia Sp., Bacillus Anthracis, Pseudomonas Aeruginosa, Yersinia Sp., Candida Albicans, Aspergillus Fumigatus, coliformes fécaux, Enterococci, rotavirus, norovirus et Ascaris Lumbricoides. Veuillez noter que la Section de l'innocuité des engrais peut exiger le dépistage d'indicateurs supplémentaires au moment de l'examen. Les tests pathogéniques doivent être effectués sur la formulation du produit final. Des contrôles utilisant des filtres chimiques et des contrôles positifs et négatifs doivent être fournis avec les données d'essai sur la formulation.

4. Considérations supplémentaires relatives à l'identification taxonomique de champignons

La classification et l'identification de champignons s'appuyaient sur les critères morphologiques jusqu'à ce que les progrès en techniques moléculaires aient permis leur application. Les techniques moléculaires sont devenues un outil important pour établir le statut taxonomique de différents champignons. La section 2 (ci-dessus) décrit de manière générale l'approche polyphasique recommandée aux fins d'identification taxonomique, laquelle s'applique aussi aux champignons.

Le dimorphisme sexuel chez les champignons ajoute à la complexité de l'identification taxonomique. De nombreux champignons présentent une forme téléomorphe (sexuelle) et une forme anamorphe (asexuelle). Ces deux formes ont souvent été dotées de noms différents et peuvent même être de familles ou de genres différents. Par ailleurs, de nombreuses paires anamorphe-téléomorphe demeurent non identifiées et sont découvertes au fur et à mesure que les données du séquençage se font disponibles. Parmi les méthodes électrophorétiques, mentionnons le polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP). Les méthodes de typage fondées sur le RFLP sont utilisées pour révéler les connexions anamorphe-téléomorphe. Plus couramment, on utilise le RFLP d'ADNr amplifié au moyen de la réaction en chaîne de la polymérase.

Lorsqu'une base de données publique est utilisée pour identifier les champignons au moyen des séquences de nucléotides, les relations connues seront déterminées; toutefois il faut garder à l'esprit que les renseignements taxonomiques peuvent différer selon les bases de données.

5. Aide pour l'identification taxonomique

Nous recommandons que les requérants demandent l'aide d'un service d'identification taxonomique ou d'un professionnel du domaine. Un certain nombre de collections importantes de cultures ou de répertoires ainsi que des laboratoires commerciaux offrent des services tarifiés aux fins d'identification et de caractérisation.

6. Classification et nomenclature taxonomiques

L'identification taxonomique du ou des micro-organismes doit être fondée sur le système de classification taxonomique actuellement utilisé et reconnu mondialement. La description du ou des micro-organismes qui entrent dans la composition du produit et ses caractéristiques doivent correspondre aux caractéristiques décrites dans les ressources et les références standards qui sont couramment utilisées par la communauté scientifique pour valider la classification taxonomique. Le nom taxonomique doit suivre le code de nomenclature officiellement reconnu par l'International Committee on Systematics of Prokaryotes (ICSP). Les demandeurs doivent vérifier la Liste approuvée des noms de bactéries afin de veiller à ce que la nomenclature soit conforme à la Liste de validation la plus récente élaborée et mise à jour par l'International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology (IJSEM).

Veuillez prendre note que la classification et la nomenclature taxonomique microbienne, particulièrement les bactéries, sont en état de changement constant étant donné que les méthodes évoluent pour engendrer une information de plus en plus fiable afin d'identifier et de classifier – ou de classifier à nouveau – le système taxonomique actuel. La vérification de concordance avec plus d'une ressource ou référence aidera à valider la désignation et la classification taxonomiques actuelles d'un micro-organisme.

Coordonnées

Section de l'innocuité des engrais
Agence canadienne d'inspection des aliments
Par téléphone : 1-855-212-7695
Courriel : cfia.paso-bpdpm.acia@inspection.gc.ca

Date de modification :