Document des décisions DD95-01 :
Détermination du risque environnemental du canola tolérant au glufosinate-ammonium d'AgrEvo Canada Inc.

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Distribué : 1995-03

Le présent document des décisions a été préparé pour exposer la décision réglementaire prise en vertu de la Directive Dir94-08, Critères d'évaluation du risque environnemental associé aux végétaux à caractères nouveaux, et de son cahier parallèle, La biologie de Brassica napus L. (Colza/canola), ainsi que du projet de directive, Pro94-94 intitulé Lignes directrices relatives à l'évaluation des végétaux à caractères nouveaux utilisés comme aliments du bétail.

Le Bureau de biotechnologie végétale et la Section des aliments du bétail de la Division des produits végétaux ont évalué les données présentées par AgrEvo Canada Inc. sur une lignée de canola tolérante au glufosinate-ammonium et résistante à la kanamycine. Ils ont déterminé que ce végétal à caractères nouveaux ne présentait pas avec l'environnement d'autres interactions que les variétés de canola actuellement commercialisées et qu'il est essentiellement équivalent au canola actuellement approuvé comme aliment du bétail.

La dissémination en milieu ouvert de la lignée de canola HCN92 tolérante au glufosinate d'AgrEvo est donc autorisée, ainsi que son utilisation dans les aliments pour animaux.

Table des matières

  1. Brève identification du végétal à caractères nouveaux (VCN)
  2. Données de base
  3. Description des caractères nouveaux
    1. Tolérance au glufosinate-ammonium
    2. Résistance à la kanamycine
    3. Méthode de mise au point
    4. Intégration stable au génome de la plante
  4. Critères d'évaluation du risque environnemental
    1. Possibilité que le VCN se comporte comme une mauvaise herbe en agriculture ou qu'il envahisse les habitats naturels
    2. Flux génétique possible vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant comme des mauvaises herbes et possédant une plus grande capacité d'envahissement
    3. Possibilité que le VCN devienne un végétal nuisible
    4. Impact possible sur des espèces non visées
    5. Répercussions possibles sur la biodiversité
  5. Critères d'évaluation pour l'utilisation comme aliment du bétail
    1. Facteurs antinutritionnels
    2. Bilan nutritionnel du VCN
  6. Décision réglementaire

I.Brève identification du végétal à caractères nouveaux (VCN)

Désignation des VCN : HCN92

Demandeur : AgrEvo Canada Inc.

Espèce végétale : Canola (Brassica napus L.)

Caractères nouveaux : tolérance au glufosinate-ammonium (herbicide);
résistance à la kanamycine (antibiotique)

Mode d'introduction des caractères : Transformation assistée par Agrobacterium tumefaciens

Utilisation proposée du VCN : Production de B. napus aux fins de la fabrication d'huile de graines pour la consommation humaine ainsi que d'huile de graines et de moulée pour le bétail; cette plante ne sera pas cultivée hors de la zone normale de production du canola.

II. Données de base

AgrEvo a mis au point une lignée de canola Brassica napus tolérante à un herbicide non sélectif et non résiduel, le glufosinate-ammonium. Cette lignée de B. napus, appelée HCN92 dans le présent document, permettra d'utiliser le glufosinate-ammonium comme herbicide de postlevée; il offrira ainsi une solution de rechange pour le désherbage dans la production de canola en réduisant la dépendance à l'égard des herbicides incorporés au sol.

La mise au point de la lignée HCN92 repose sur la technologie de l'ADN recombinant: il s'est agi en l'occurrence d'introduire deux gènes bactériens dans une lignée de B. napus. On y a inséré un gène qui lui confère une tolérance au glufosinate-ammonium en codant une enzyme, la phosphinothricine- acétyltransférase, qui inactive le glufosinate-ammonium par acétylation. On y a également inséré un autre gène qui confère la résistance à la kanamycine; ce gène est sans intérêt agronomique, mais on y a fait appel pour séparer les plantes modifiées de celles qui ne l'ont pas été au stade de la mise au point.

La lignée HCN92 a fait au Canada l'objet d'essais au champ en milieu fermé en Saskatchewan (1990-1994), en Alberta (1991-1994), au Manitoba (1991-1994) et en Ontario (1993-1994).

AgrEvo a fourni des données sur l'identité de la lignée HCN92, une description détaillée de la méthode de modification, des données et des renseignements sur la stabilité des gènes introduits, le rôle des gènes introduits dans les organismes donneurs et celui des séquences régulatrices chez ces mêmes organismes, leur caractérisation moléculaire et les séquences nucléotidiques complètes. Les nouvelles protéines ont été identifiées et caractérisées, y compris leur éventuelle toxicité pour le bétail et les espèces non visées, leur pouvoir allergène et leur degré d'expression dans la plante et les aliments pour le bétail. De nombreuses publications scientifiques détaillées ont également été fournies.

Les caractéristiques agronomiques, telles la production de graines, la durée de maturation, la période de floraison et les fécondités mâle et femelle, ont été comparées à celles des homologues (variétés non modifiées de B. napus). Les effets des résidus de la lignée HCN92 sur la croissance et la productivité des céréales, des cultures fourragères et des légumineuses alimentaires de la saison suivante ont été évalués.

AgrEvo a aussi fourni des données sur les adaptations de survie de la lignée HCN92 : potentiel d'éclatement de la silique, dormance des graines, mécanismes de dissémination des graines, vigueur végétative, caractéristiques de reproduction et apparition dans les années subséquentes de ressemis spontanés dans des conditions de jachère chimique ou mécanique. L'adaptation au stress a été évaluée, notamment la vulnérabilité aux divers ravageurs et pathogènes de B. napus, aux stress abiotiques comme la salinité du sol et le régime hygrométrique et aux herbicides autres que le glufosinate-ammonium normalement employés pour les cultures de canola. Des études du pouvoir envahissant ont été effectuées dans des conditions perturbées, naturelles et culturales.

L'entreprise a fourni des données pour prouver l'utilité de la lignée HCN92 comme aliment pour le bétail. Une analyse quantitative portant sur les protéines totales, les matières grasses totales, les fibres brutes, les cendres et l'énergie brute a été fournie pour la graine entière, la moulée transformée et l'huile.

L'Agence canadienne d'inspection des aliments a examiné les données susmentionnées en fonction des critères d'évaluation pour déterminer le risque environnemental des végétaux à caractères nouveaux ainsi qu'ils sont exposés dans la Directive Dir94-08, Critères d'évaluation du risque environnemental associé aux végétaux à caractères nouveaux :

  • la possibilité que le VCN se comporte comme une mauvaises herbe en agriculture ou qu'il envahisse les habitats naturels;
  • le flux génétique possible vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant comme des mauvaises herbes et possédant une plus grande capacité d'envahissement;
  • la possibilité que le VCN devienne un végétal nuisible;
  • l'impact possible du VCN ou de ses produits géniques sur des espèces non visées, y compris les humains;
  • les répercussions possibles sur la biodiversité.

L'Agence canadienne d'inspection des aliments a également étudié l'information dont il est question ci-dessus en fonction des critères d'évaluation pour déterminer l'innocuité et l'efficacité des aliments pour le bétail, tels qu'ils sont décrits dans Pro94-04 :

  • effets possibles sur le bétail,
  • effets possibles sur la nutrition du bétail.

III. Description des caractères nouveaux

1. Tolérance au glufosinate-ammonium

  • L'ingrédient actif du glufosinate-ammonium, la phosphinothricine (PPT), inhibe la glutamine-synthétase, ce qui produit une accumulation de concentrations létales d'ammoniaque dans les plants prédisposés quelques heures après son application.
  • Le gène de la tolérance à la phosphinothricine introduit dans la lignée HCN92 par les techniques du génie génétique code la phosphinothricine-acétyltransférase (PAT). Cette enzyme détoxifie la phosphinothricine par acétylation et en fait un composé inactif. Elle présente une spécificité du substrat extrêmement élevée; les données expérimentales montrent clairement que la PAT ne peut pas acétyler l'acide L-glutamique, un analogue de la L-PPT, ni le D-PPT, ni aucun acide aminé des protéines.
  • Le gène de la PAT a été à l'origine isolé dans un actinomycète aérobie du sol, Streptomyces viridochromogenes. La PAT est donc présente à l'état naturel dans le sol. En termes plus généraux, les acétyltransférases sont omniprésentes dans la nature.
  • Le gène est lié à un promoteur constitutif, et l'expression de la protéine a été décelée dans les racines, les feuilles, les bourgeons et les graines. Elle ne l'a toutefois pas été dans les tissus de la tige, les extraits protéiques du pollen ou le miel non traité. L'expression maximum était de 0,001 % des protéines totales de la plante.
  • La PAT exprimée a été comparée à la protéine bactérienne : les poids moléculaires étaient semblables, ce qui montre que la protéine n'avait pas été glycosylée et n'avait pas subi de modification après transcription. Les études montrent que l'enzyme devient inactive en une minute dès qu'elle est soumise aux conditions qui règnent normalement dans l'estomac des mammifères et le devient aussi pendant la transformation en ingrédients d'aliments pour animaux.
  • La séquence nucléotidique du gène et la séquence des acides aminés de l'enzyme ont été fournies. La séquence nucléotidique ne présentait d'homologie importante avec aucune toxine et aucun allergène qui se trouvent dans la base de données GENEBANK DNA.

2. Résistance à la kanamycine

  • La kanamycine est un antibiotique de type aminoglucoside qui, en se fixant aux ribosomes bactériens, perturbe la synthèse normale des protéines et tue la cellule bactérienne.
  • Le gène de la résistance à la kanamycine code une enzyme qui empêche l'antibiotique de se fixer aux ribosomes et rend de ce fait les cellules résistantes. AgrEvo considère la nature exacte de l'enzyme comme renseignement commercial confidentiel. Il a décrit la source du gène et fourni la séquence nucléotidique complète.
  • Le gène est lié à un promoteur constitutif faible; son expression est toujours plus forte dans les tissus des racines, mais on l'observe également dans les bourgeons, les feuilles et les graines brutes. L'enzyme n'a pas été décelée dans le miel non traité ni dans le pollen; par ailleurs, elle devient inactive pendant la transformation en ingrédients d'aliments pour animaux.
  • L'enzyme PAT exprimée a été comparée à la protéine bactérienne : les poids moléculaires sont semblables, ce qui montre que la protéine n'a pas été glycosylée et n'a pas subi de modification après transcription.
  • La séquence nucléotidique ne présente d'homologie importante avec aucune toxine et aucun allergène qui se trouvent dans la base de données GENEBANK DNA.

3. Méthode de mise au point

  • Le cultivar Topas de Brassica napus a été transformé à l'aide d'un vecteur désarmé non pathogène, Agrobacterium tumefaciens; ce vecteur contenait la région de l'ADN-T d'un plasmide d'Agrobacterium dont on avait supprimé la virulence et les gènes pathogènes pour les remplacer par des gènes codant la tolérance au glufosinate-ammonium et la résistance à la kanamycine. On sait que l'ADN-T du plasmide s'insère au hasard dans le génome de la plante et que l'insertion est ordinairement stable, comme c'est le cas chez la lignée HCN92.
  • Le transformant a été croisé avec la lignée ACSN3 de B. napus, puis avec la lignée AC Excel; la lignée HCN92 a été tirée d'une masse de plants F3 issus du croisement.

4. Intégration stable au génome de la plante

  • D'après les données fournies, il n'y a intégration d'aucune région codante située à l'extérieur des bordures de l'ADN-T, et l'intégration des gènes ne se produit qu'en un seul site d'insertion.
  • La lignée HCN92 est séparée du transformant original par plusieurs générations. En comparant la plante transgénique initiale et la lignée HCN92, on ne constate pas de différence pour ce qui est de la présence et de l'expression des deux gènes ni pour ce qui est du site d'insertion.

IV. Critères d'évaluation du risque environnemental

1. Possibilité que le VCN se comporte comme une mauvaises herbe en agriculture ou qu'il envahisse les habitats naturels

L'Agence canadienne d'inspection des aliments a évalué les données présentées par AgrEvo sur la biologie de reproduction et de survie de la lignée HCN92 et a conclu que la vigueur végétative, la survie hivernale, la période de floraison, la durée de maturation, la production de graines et la dormance se situaient dans la gamme normale de l'expression des caractères des variétés non modifiées de B. napus. On n'a pas ajouté à la lignée HCN92 de gènes spécifiques de la tolérance au froid ou de l'hibernation; AgrEvo n'a constaté la présence d'aucun plant ayant survécu à l'hiver dans les années après récolte qui ont suivi les essais au champ, et le nombre de plants qui se sont ressemés spontanément l'année suivant un essai au champ était comparable d'une parcelle de HCN92 à une parcelle d'une autre variété de B. napus. Comme la morphologie des graines et leur poids moyen sont restés les mêmes, le potentiel de dissémination des graines n'est pas modifié.

D'après les données présentées, ACIA a conclu que la lignée HCN92 ne montre pas d'autre adaptation au stress que sa résistance au glufosinate-ammonium. Sa résistance ou sa vulnérabilité aux principaux ravageurs et pathogènes de B. napus (par exemple la jambe noire du canola, la sclérotiniose, les altises) se situent dans la gamme actuellement manifestée par les variétés commerciales. Le stress hygrométrique exerce des effets fort nocifs sur la lignée HCN92, comme sur ses homologues.

La biologie de B. napus, décrite dans La biologie de Brassica napus L. (Colza/canola), montre que les plants non modifiés de cette espèce n'envahissent pas les habitats naturels du Canada. D'après l'information fournie par AgrEvo, on a pu conclure que la lignée HCN92 ne diffère pas de ses homologues sous ce rapport. Son pouvoir envahissant a été étudié dans des habitats perturbés et non perturbés. Les données montrent que la lignée HCN92 n'est pas plus envahissante ni plus persistante que ses homologues commerciaux. Aucun avantage concurrentiel n'a été conféré aux plantes qui tolèrent le glufosinate-ammonium à part, précisément, cette tolérance.

Le glufosinate-ammonium n'est pas employé dans les cycles normaux de rotation des cultures; il n'y a donc pas lieu de se préoccuper de la résistance dans la réglementation de la lutte contre les mauvaises herbes. Les ressemis spontanés de B. napus résistant au glufosinate sont faciles à éliminer par des moyens mécaniques et d'autres produits chimiques employés pour enrayer B. napus.

Ajoutées au fait que les caractères nouveaux n'ont pas d'effet délibéré sur le caractère de mauvaise herbe ou le pouvoir envahissant, les considérations susmentionnés ont amené ACIA à conclure que la lignée HCN92 ne présente pas de potentiel d'envahissement différent de celui des variétés de canola actuellement commercialisées.

REMARQUE : Comme préoccupation à plus longue échéance, il faut citer, en cas d'adoption généralisée de plusieurs systèmes différents de culture et de lutte contre les mauvaises herbes à l'aide d'herbicides spécifiques, l'apparition éventuelle de cultures spontanées présentant des résistances nouvelles à divers herbicides. Ce phénomène pourrait faire perdre l'usage de ces herbicides et de leurs avantages éventuels. Le personnel de vulgarisation agricole des secteurs public et privé doit donc promouvoir des pratiques de gestion prudentes auprès des agriculteurs qui font appel à ces cultures tolérantes aux herbicides afin de réduire au minimum l'apparition d'une résistance multiple.

2. Flux génétique possible vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant comme des mauvaises herbes et possédant une plus grande capacité d'envahissement

On sait que les plants de Brassica napus sont sujets à des croisements hétérogènes avec d'autres plants de la même espèce à une fréquence pouvant atteindre 30 %, et potentiellement avec ceux des espèces B. rapa, B. juncea, B., B. nigra, Diplotaxis muralis, Raphanus raphanistrum et Erucastrum gallicum (La biologie de Brassica napus L. (Colza/canola)). Les études indiquent que c'est surtout avec l'autre grande espèce de canola, B. rapa, et sa forme sauvage qui se comporte parfois comme une mauvaise herbe sur des terres cultivées, surtout dans les provinces de l'Est canadien, que l'introgression du gène de la tolérance aux herbicides est le plus susceptible de se produire.

Si des individus tolérants au glufosinate-ammonium apparaissaient par hybridation interspécifique ou intergénérique, les caractères nouveaux ne leur conféreraient pas d'avantage concurrentiel, sauf si on essayait de les supprimer à l'aide de glufosinate-ammonium, ce qui ne se produirait dans les écosystèmes aménagés que si l'on utilisait le glufosinate-ammonium pour le désherbage non sélectif, par exemple dans la culture de cultivars mis au point pour tolérer le glufosinate-ammonium et où l'on utiliserait ce dernier pour enrayer les mauvaises herbes. Comme le B. napus tolérant au glufosinate-ammonium, ces individus tolérants aux herbicides, s'il en apparaissait, seraient faciles à détruire par des moyens mécaniques et d'autres produits chimiques. Les hybrides, s'il en poussait, pourraient éventuellement faire perdre l'usage du glufosinate-ammonium comme agent de lutte contre ces espèces, mais avec de bonnes techniques de gestion des cultures, c'est un problème qu'on pourrait éviter.

Les considérations susmentionnées ont amené ACIA à conclure que le flux génétique entre la lignée HCN92 et les espèces apparentées de canola est possible, mais qu'il ne rendrait pas ces dernières plus envahissantes ni plus nuisibles aux cultures.

3. Possibilité que le VCN devienne un végétal nuisible

Les effets recherchés des deux caractères nouveaux sont sans rapport avec les possibilités qu'a le VNC de devenir un végétal nuisible, ce que Brassica napus n'est pas au Canada (Dir 94-09). De plus, on constate que les propriétés culturales de la lignée HCN92, son adaptation aux stress et sa composition qualitative et quantitative se situent dans la gamme des valeurs exhibées par les variétés de B. napus actuellement commercialisées, ce qui nous pousse à conclure que les possibilités que la plante a de devenir un végétal nuisible n'ont pas été modifiées par inadvertance.

ACIA a donc conclu que la lignée HCN92 ne montrait pas de possibilités nouvelles de devenir un végétal nuisible.

4. Impact possible sur des espèces non visées

ACIA a examiné les données relatives aux effets des résidus végétaux de la lignée HCN92 sur le rendement agronomique des cultures ultérieures de blé, d'orge, de lentilles, de pois, de lin et de luzerne. Il n'a pas constaté de différence significative entre les parcelles de HCN92 et celles d'autres variétés de canola au chapitre du nombre de plants ou de la production de graines. Il s'agit là d'un signe indirect de ce que les bactéries du sol qui interviennent dans le maintien de la fertilité ne subissent pas d'effet nocif de la part des résidus végétaux de la lignée HCN92.

On n'a pas décelé d'activité de l'enzyme PAT dans les grains de pollen ni dans le miel non traité recueilli dans une ruche dont les abeilles avaient butiné la lignée de B. napus tolérante au glufosinate. On n'a pas non plus constaté d'effet nocif sur les abeilles qui butinaient la lignée HCN92, pas plus que sur le développement du couvain. Les deux enzymes sont rapidement inactivées dans les fluides stomacaux et intestinaux des mammifères sous l'effet de la dégradation enzymatique et de la protéolyse facilitée par le pH. Aucune des deux nouvelles protéines ne contient de sites potentiels de glycosylation ni ne possède de stabilité protéolytique ou thermique, ce qui indique qu'aucune n'est un allergène probable. Une recherche dans la base de données sur les séquences d'ADN de la GENEBANK n'a révélé aucune homologie significative avec des toxines ou des allergènes connus.

Compte tenu de ce qui précède, ACIA a conclu que la dissémination en milieu ouvert de la lignée HCN92 n'aurait pas sur les organismes en interaction, et notamment sur les humains, d'autres effets que ceux des variétés homologues actuellement commercialisées.

5. Répercussions possibles sur la biodiversité

La lignée HCN92 ne présente pas de caractère phénotypique nouveau qui en étendrait l'usage au-delà de l'actuelle répartition géographique de la production de canola au Canada. Comme les espèces résultant de la pollinisation croisée ne se rencontrent que dans les habitats perturbés, le transfert des caractères nouveaux serait sans conséquence sur les milieux naturels. Les études ont montré à ACIA que la lignée HCN92 n'envahissait pas les habitats naturels et qu'elle n'était pas plus concurrentielle que ses homologues, dans les écosystèmes naturels comme dans les écosystèmes aménagés.

L'Agence canadienne d'inspection des aliments a donc conclu que les effets éventuels de la lignée HCN92 sur la biodiversité étaient équivalents à ceux des lignées de canola actuellement commercialisées.

V. Critères d'évaluation pourl'utilisation comme aliment du bétail

1. Facteur antinutritionnels

L'intervalle de confiance a été évalué à 95 % pour la teneur en glucosinolates et en acide érucique de la moulée et de l'huile produites à partir de la lignée HCN92 cultivée dans diverses conditions. Cet intervalle de confiance prouve que le VCN contient ces facteurs antinutritionnels en concentrations inférieures aux normes prescrites pour les fractions tant de moulée que d'huile, soit < 30 micromoles de glucosinolates par gramme de moulée sèche et < 2 % d'acide érucique dans l'huile.

2. Bilan nutritionnel du VCN

On n'a constaté aucune différence statistique de bilan nutritionnel (teneur en protéines totales, en matières grasses totales, en fibres brutes, en cendres et en énergie brute) chez la graine entière, la graine transformée en moulée ou l'huile entre la lignée HCN92 et les cultivars commerciaux actuels de canola. Dans l'ensemble, ces résultats prouvent que l'introduction de cette construction dans B. napus pour créer la lignée HCN92 n'a vraisemblablement pas eu d'effet secondaire sur le bilan nutritionnel ou la valeur nutritive du cultivar. Par conséquent, la lignée HCN92 a été jugée essentiellement équivalente aux variétés traditionnelles de canola sur le plan du bilan nutritionnel.

VI. Décision réglementaire

Après examen des données et des renseignements présentés par AgrEvo Canada Inc. et comparaison détaillée de la lignée HCN92 avec les variétés non modifiées de B. napus, ACIA a conclu que ni les nouveaux gènes, ni les produits géniques qui en résultent et les nouveaux caractères qui y sont associés ne confèrent à la lignée HCN92 d'avantage écologique voulu ou non voulu. Si ces caractères étaient transférés par pollinisation croisée à des végétaux apparentés, ils ne se traduiraient pas non plus par un avantage écologique quelconque.

Après examen des données et des renseignements présentés, ACIA a conclu que les nouveaux gènes et leurs caractères correspondants ne suscitent pas en soi d'inquiétude quant à l'innocuité ou à la valeur nutritive de cette lignée. L'huile et la moulée de canola sont actuellement décrites dans l'annexe IV du Règlement sur les aliments du bétail et l'utilisation en est donc approuvée dans les aliments destinés au bétail au Canada. Comme la lignée HCN92 a été déclarée, après évaluation, essentiellement équivalente, elle et ses dérivés sont considérés comme répondant aux définitions actuelles et leur utilisation comme ingrédients des aliments pour le bétail au Canada est approuvée.

La dissémination en milieu ouvert dans l'environnement de la lignée HCN92 et d'autres lignées de B. napus qui en dérivent est donc, en l'absence d'introduction d'un autre caractère nouveau, considérée comme sans danger.

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