DD1997-21 : Détermination du risque environnemental associé aux lignées de cotonnier (Gossypium hirsutum L.) renfermant des gènes Roundup Ready™

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Distribué : 1997-03

Le présent document de décisions vise à expliquer la décision réglementaire prise conformément à la directive Dir95-03, Lignes directrices relatives à l'évaluation des végétaux à caractères nouveaux utilisés comme aliments du bétail, et à la directive Dir94-08, Critères d'évaluation du risque environnemental associé aux végétaux à caractères nouveaux.

L'Agence canadienne d'inspection des aliments (ACIA), et plus précisément la Section des aliments du bétail de la Division des produits végétaux, avec la participation de l'Unité d'évaluation des risques phytosanitaires de l'ACIA et les conseils du Bureau de biotechnologie végétale de l'ACIA, a évalué les données présentées par la société Monsanto Canada à l'égard de certaines lignées de cotonnier. Ces lignées sont issues de végétaux modifiés par l'insertion de gènes leur conférant une tolérance au glyphosate, matière active de l'herbicide Roundup®, et une résistance à la kanamycine, comme marqueur pour la sélection. L'ACIA a établi que les aliments du bétail dérivés de ces végétaux à caractères nouveaux ne devraient pas présenter de risques pour l'environnement ni pour l'alimentation du bétail.

L'utilisation, comme aliments du bétail, de la graine et du tourteau provenant des lignées 1445 et 1698 de cotonnier tolérant le glyphosate est donc autorisée. L'utilisation à cette fin de toute autre lignée et de tout hybride intraspécifique de Gossypium hirsutum qui seraient issus de la même transformation est également autorisée, pourvu qu'aucun croisement interspécifique ne soit réalisé, que l'utilisation prévue soit semblable et qu'une caractérisation approfondie ait démontré que ces végétaux ne présentent aucun autre caractère nouveau.

Table des matières

  1. Brève identification des végétaux à caractères nouveaux (VCN)
  2. Données de base 1D
  3. Description des caractères nouveaux
    1. Les gènes Roundup-Ready
    2. Résistance à la kanamycine
    3. Méthode de mise au point
    4. Stabilité de l'intégration au génome de la plante
  4. Critères d'évaluation du risque environnemental
    1. Possibilité que les VCN deviennent des mauvaises herbes pour l'agriculture ou envahissent des habitats naturels
    2. Possibilités de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant davantage en mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement
    3. Possibilité que les VCN deviennent nuisibles
    4. Impact possible sur les organismes non visés
    5. Impact possible sur la biodiversité
  5. Évaluation nutritionnelle comme aliment du bétail
    1. Facteurs antinutritionnels
    2. Composition nutritionnelle des VCN
  6. Décision réglementaire

I. Brève identification des végétaux à caractères nouveaux (VCN)

Désignation des VCN : Lignées 1445 et 1698 de cotonnier Roundup-Ready™.

Demandeur : Monsanto Canada Inc.

Espèce végétale : Cotonnier (Gossypium hirsutum L.).

Caractères nouveaux : Résistance nouvelle au glyphosate (matière active de l'herbicide Roundup®), conférée par les gènes Roundup-Ready™; résistance à la kanamycine (antibiotique).

Méthode d'introduction des caractères : Transformation au moyen de l'Agrobacterium tumefaciens.

Utilisation proposée des VCN : Production de coton comme fibre, de graine et de tourteau de coton comme aliments du bétail et d'huile de coton pour la consommation humaine. Les VCN seront cultivés à l'extérieur du Canada, dans les zones habituelles de production de coton. La graine et le tourteau seront importés au Canada uniquement pour l'alimentation du bétail.

II. Données de base

La société Monsanto a mis au point des lignées de cotonnier issues de la variété Coker 312, chez lesquelles s'expriment les gènes Roundup-Ready™ dont cette société détient le brevet. Ces gènes confèrent une tolérance nouvelle au glyphosate, matière active de l'herbicide Roundup®, qui permet de lutter contre des mauvaises herbes importantes des cultures de coton ou même d'éliminer ces mauvaises herbes.

La création des lignées de cotonnier tolérant le glyphosate, basée sur la technique de l'ADN recombinant, résulte de l'insertion de deux gènes bactériens (les gènes Roundup-Ready™) dans la variété Coker 312. Un de ces gènes confère au site biochimique où agit le Roundup® une sensibilité réduite à cet herbicide, tandis que l'autre code une enzyme qui permet au végétal de dégrader le glyphosate. L'expression des deux gènes est dirigée vers les chloroplastes, où se situe l'activité de l'herbicide, par l'ajout de séquences de codage provenant d'un peptide de transport d'origine végétale. Les deux gènes ont été introduits parallèlement à un troisième gène, qui confère une résistance à un antibiotique, la kanamycine, et ne présente aucun intérêt agronomique : il a seulement servi, pendant la mise au point des VCN, à distinguer les sujets modifiés des sujets non modifiés.

Les lignées de cotonnier tolérant le glyphosate ont fait l'objet d'essais au champ dans 65 localités de Porto Rico et de la partie continentale des États-Unis. Leur commercialisation a fait l'objet d'une approbation complète dans ce pays. Par ailleurs, Santé Canada a établi que l'huile de coton provenant de ces lignées est essentiellement équivalente de celle produite à partir des cotonniers déjà commercialisés (décision du 19 décembre 1996).

La Monsanto a décrit en détail la méthode de transformation utilisée et fourni des données sur l'identité des lignées tolérantes, sur les sites d'insertion des gènes, sur le nombre de copies et le degré d'expression des gènes dans la plante ainsi que sur le rôle des gènes insérés et des séquences régulatrices chez les organismes donneurs. Elle a également produit les séquences nucléotidiques complètes. Les protéines nouvelles ont été identifiées, caractérisées et comparées aux protéines bactériennes originales, notamment sur le plan de leur toxicité potentielle pour le bétail. La Monsanto a également fourni copie de publications scientifiques pertinentes.

Certaines caractéristiques agronomiques des VCN, comme la vigueur des plants, la croissance, la morphologie, la germination et la floraison, ont été comparées à celles de contreparties de cotonnier non modifiées. On a également évalué la capacité d'adaptation des VCN au stress et notamment leur sensibilité à divers ravageurs et pathogènes.

La Monsanto a aussi fourni des données visant à montrer que la graine et le tourteau de coton provenant des lignées tolérantes conviennent à l'alimentation du bétail. Au moyen d'analyses immédiates, elle a établi la teneur de ces produits en protéines brutes, en lipides bruts, en fibres brutes, en cendres et en énergie brute. De plus, comme la modification génétique touche une enzyme faisant partie de la voie de synthèse des acides aminés aromatiques, la Monsanto a fourni le profil d'acides aminés des lignées transformées.

La Section des aliments du bétail a passé en revue les renseignements qui précèdent, avec la participation de la Division de l'évaluation des risques phytosanitaires de l'ACIA et les conseils de la Section de la biotechnologie végétale. Pour évaluer le risque environnemental associé aux aliments du bétail dérivés de ces végétaux à caractères nouveaux et déterminer s'ils conviennent à l'alimentation des animaux de ferme, on a utilisé les critères suivants, décrits dans les directives de réglementation Dir94-08 et Dir95-03 :

  • impact possible sur le bétail lui-même;
  • impact possible sur la nutrition du bétail;
  • impact possible des VCN ou de leurs produits géniques sur des espèces non visées, y compris l'être humain;
  • possibilité que les VCN deviennent nuisibles;
  • possibilité que les VCN deviennent des mauvaises herbes pour l'agriculture ou envahissent les habitats naturels;
  • impact possible sur la biodiversité;
  • flux génétique possible vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant davantage en mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement.

III. Description des caractères nouveaux

1. Les gènes Roundup-Ready

  • Une construction génétique renfermant deux gènes qui confèrent une tolérance au glyphosate, matière active de l'herbicide Roundup®, a été utilisée pour transformer la lignée 1445. Une construction semblable ne renfermant qu'un de ces gènes a été utilisée pour transformer la lignée 1698.
  • Le premier gène code l'enzyme CP4 EPSPS, variante bactérienne (provenant de la souche CP4 de l'Agrobacterium tumefaciens) d'une enzyme végétale, la 5-énolpyruvylshikimate- 3-phosphate synthétase (EPSPS), qui joue un rôle dans la voie shikimique de biosynthèse des acides aminés aromatiques. Le glyphosate inhibe l'activité de l'enzyme EPSPS normalement produite par la plante, ce qui bloque la voie shikimique et interrompt la synthèse de ces acides aminés essentiels. L'enzyme CP4 EPSPS est une variante qui tolère le glyphosate et possède une forte activité catalytique. L'introduction de cette enzyme bactérienne permet à la synthèse des acides aminés aromatiques de se poursuivre même en présence de la pression de sélection exercée par le glyphosate.
  • Le second gène, gox, est dérivé de l'Achromobacter sp., bactérie omniprésente dans le sol. Il code une enzyme qui décompose le glyphosate en acide aminométhylphosphonique et en glyoxylate. Bien que la lignée 1595 ait été transformée au moyen d'un vecteur renfermant les deux gènes Roundup-Ready™, une analyse par transfert d'ADN (southern blot) a révélé que le gène gox ne s'était pas inséré dans le génome de cette lignée. La lignée 1698 a été transformée au moyen d'un vecteur ne renfermant pas le gène gox. Chez les deux lignées, une épreuve ELISA a permis de confirmer la non-expression de ce gène.
  • Une séquence de codage d'origine végétale codant un peptide chloroplastique de transport a été co-introduite avec chacun des deux gènes. Ce peptide de transport aide les protéines résultant de l'expression des deux gènes à pénétrer dans les chloroplastes, où se situent la voie shikimique de biosynthèse ainsi que l'activité du glyphosate.
  • Le gène codant l'enzyme CP4 EPSPS et la séquence codant le peptide de transport sont liés à un même promoteur constitutif. Chez la lignée 1445, la production moyenne de l'enzyme était de 0,082 µg/mg de tissus frais dans les graines et de 0,052 µg/mg de tissus frais dans les feuilles. Chez la lignée 1698, elle était de 0,205 µg/mg de tissus frais dans les graines et de 0,031 µg/mg de tissus frais dans les feuilles.
  • La séquence d'acides aminés de l'enzyme produite par le végétal ne présentait aucune homologie avec celle des toxines ou allergènes connus, énumérés dans une base de données montée à partir des bases Swissprot, Genepept et Pir protein. D'ailleurs, il s'agit d'une substance commune dans la nature, qui ne devrait avoir aucun effet toxique ou allergène. La Monsanto a présenté des données qui montrent que l'enzyme CP4 EPSPS devient rapidement inactive lorsqu'elle est exposée à la chaleur ou à des substances simulant les sucs gastriques des mammifères.

2. Résistance aux antibiotiques

  • La kanamycine est un antibiotique de type aminoside qui se lie aux ribosomes bactériens, causant ainsi une perturbation de la synthèse normale des protéines et la mort de la cellule bactérienne.
  • Le gène de la résistance à la kanamycine, isolé à partir de la bactérie E. coli, code la néomycine-phosphotransférase de type II (NPT II), enzyme provoquant la phosphorylation de la kanamycine, ce qui empêche celle-ci de se lier aux ribosomes, rendant par le fait même la cellule résistante.
  • Le gène est lié à un promoteur constitutif. Chez la lignée 1445, la production moyenne de protéine NPT II était de 0,045 µg/mg de tissus frais dans les feuilles et de 0,0067 µg/mg de tissus frais dans les graines. Chez la lignée 1698, elle était de 0,311 µg/mg de tissus frais dans les feuilles et de 0,204 µg/mg de tissus frais dans les graines.
  • La protéine est omniprésente dans l'environnement. Elle se dégrade rapidement in vitro, en présence de substances simulant les sucs gastriques et intestinaux des mammifères.
  • La séquence nucléotidique ne présente aucune homologie appréciable avec celle des toxines et allergènes énumérés dans la base de données GENEBANK.
  • La séquence nucléotidique complète et la séquence d'acides aminés correspondante ont été fournies.
  • Au cours de la mise au point des VCN, on a aussi utilisé un gène conférant une résistance à la streptomycine et à la spectinomycine, comme marqueur pour la sélection des transformants bactériens. Ce gène est activé par un promoteur bactérien, et sa non- expression dans le végétal nouveau a été confirmée par une épreuve ELISA spécifique.

3. Méthode de mise au point

  • Le cotonnier Coker 312 a été transformé à l'aide d'un vecteur non pathogène désarmé. Ce vecteur contenait la séquence ADN-T d'un plasmide d'Agrobacterium tumefaciens dont les gènes responsables de la virulence et des maladies des plantes avaient été enlevés et où on avait inséré les gènes conférant la tolérance au Roundup® et la résistance à la kanamycine. On sait que la séquence ADN-T du plasmide s'insère au hasard dans le génome de la plante. Cette insertion est généralement stable, comme le montre le cas des lignées de cotonnier tolérant le glyphosate.

4. Stabilité de l'intégration au génome de la plante

  • Chez les deux lignées, l'ADN-T inséré, y compris les gènes partiels, a pu être bien caractérisé par analyse des enzymes de restriction. Les gènes sont demeurés stables pendant cinq générations. La Monsanto a fourni des analyses par transfert d'ADN (southern blot) démontrant la stabilité des gènes codant les enzymes CP4 EPSPS et NPT II : l'ADN correspondant à ces gènes était encore présent dans les générations R3 et R5.

IV. Critères d'évaluation du risque environnemental

1. Possibilité que les VCN deviennent des mauvaises herbes pour l'agriculture ou envahissent des habitats naturels

Le cotonnier (Gossypium hirsutum) appartient à la famille des Malvacées. L'espèce est vivace mais se cultive comme une annuelle. Aux États-Unis, elle se cultive principalement dans la zone qui s'étend, d'est en ouest et vers le sud, de la Virginie à la Californie. Le cotonnier n'est pas considéré comme une mauvaise herbe dans les régions où on le cultive. Il n'est pas cultivé au Canada, car il ne peut s'adapter aux conditions écologiques qui caractérisent ces latitudes.

Les lignées de cotonnier tolérant le glyphosate ne présentent aucun gène nouveau leur conférant spécifiquement une tolérance au froid ou une capacité de survie hivernale. D'ailleurs, elles ne seront cultivées dans aucune région du Canada.

Étant donné les caractéristiques biologiques du G. hirsutum, décrites dans la demande, les sujets non modifiés de cette espèce ne peuvent envahir les habitats sauvages au Canada. Selon les renseignements fournis par la Monsanto, les lignées renfermant les gènes Roundup-Ready™ ne sont pas différentes de leurs contreparties à cet égard.

2. Possibilités de flux génétique vers des espèces sauvages apparentées risquant de produire des hybrides se comportant davantage en mauvaises herbes ou possédant une plus grande capacité d'envahissement

Le pollen du cotonnier est lourd et collant, et la fécondation croisée requiert normalement des insectes pollinisateurs, comme les bourdons et l'abeille domestique. Comme la plante est normalement autofécondée, la gamme des croisements naturels entre cotonniers est très limitée.

Les cotonniers sauvages (G. barbadense et G. tomentosum) ne sont présents que dans les régions arides des zones tropicales et subtropicales. Il n'existe au Canada aucune espèce sauvage apparentée qui puisse s'hybrider naturellement avec le G. hirsutum. En conséquence, l'ACIA conclut qu'un flux génétique depuis les lignées tolérantes vers des espèces voisines du cotonnier ne peut se produire au Canada.

3. Possibilité que les VCN deviennent nuisibles

L'effet recherché au moyen des deux caractères nouveaux n'a aucun lien avec le fait que les VCN puissent devenir des mauvaises herbes, sans compter que le cotonnier n'est pas une espèce nuisible au Canada. En outre, les caractéristiques agronomiques des lignées de cotonnier tolérant le Roundup® se sont révélées semblables à celles des variétés déjà commercialisées. La sensibilité aux maladies telles que la brûlure bactérienne, la pourriture des capsules, la verticilliose et la brûlure ascochytique est également demeurée la même. De même, aucune différence n'a été relevée entre les lignées transformées et non transformées quant à leur sensibilité aux insectes ravageurs : la réaction des lignées transformées et des témoins a été comparable dans le cas des pucerons, de l'anthonome du cotonnier, de la noctuelle verdoyante, du ver de l'épi du maïs et des thrips.

L'ACIA considère donc que les lignées tolérant le Roundup® ne risquent pas plus de devenir nuisibles que la variété dont elles sont issues.

4. Impact possible sur les organismes non visés

La caractérisation détaillée du gène nouveau et de l'enzyme correspondante, brièvement résumée dans la partie III du présent document, a permis de conclure que ce gènes et cette enzyme n'ont pas rendu les végétaux plus toxiques ou plus allergènes. L'enzyme est d'ailleurs extrêmement répandue chez les micro-organismes, les champignons et les végétaux et est rapidement inactivée par les sucs gastriques et intestinaux des mammifères, par dégradation enzymatique et protéolyse acide.

On sait par ailleurs que le coton produit des facteurs antinutritionnels et que sa graine crue ne convient pas à l'alimentation des animaux monogastriques. En ce qui concerne leur teneur en gossypol, composé toxique, les deux lignées ne présentaient pas de différence significative par rapport aux contreparties non transformées. Il en était de même pour les acides gras cyclopropénoïdes (acides dihydrosterculique, sterculique et malvalique), également toxiques. Enfin, chez les deux lignées, les quatre aflatoxines primaires associées au cotonnier n'étaient pas présentes en quantités détectables.

À la lumière de ces renseignements, l'ACIA estime que l'utilisation des lignées tolérant le Roundup® pour l'alimentation du bétail, au lieu des variétés actuellement commercialisées de cotonnier, n'aurait pas de répercussions différentes pour l'être humain et pour les autres espèces ayant des interactions avec le G. hirsutum.

5. Impact possible sur la biodiversité

L'ACIA a établi que les lignées tolérantes n'auront aucun impact sur la biodiversité. En effet, elles ne présentent aucune caractéristique phénotypique nouvelle qui puisse en étendre l'utilisation au Canada depuis les zones actuelles de culture du cotonnier. Comme cette espèce ne s'hybride au Canada avec aucune espèce sauvage apparentée, aucun caractère nouveau ne sera transféré dans les milieux sauvages.

V. Évaluation nutritionnelle comme aliment du bétail

1. Facteurs antinutritionnels

La graine de coton renferme un grand nombre de facteurs antinutritionnels, et la graine crue ne convient pas à l'alimentation des animaux monogastriques. La transformation de la graine permet cependant de diminuer sa teneur en toxines endogènes et d'en faire un tourteau convenant à l'alimentation du bétail. Chez la lignée 1445, la teneur de la graine en gossypol était significativement plus élevée que chez les cotonniers Coker 312 utilisés comme témoins. Cependant, des études plus approfondies sur des isolignées issues de la lignée 1445 n'ont permis de révéler aucune tendance à acquérir des teneurs plus élevées en gossypol, par rapport aux cotonniers Coker 312 utilisés comme témoins. Les auteurs de des études en ont conclu que les teneurs élevées en gossypol n'étaient pas reliées à la tolérance au glyphosate. Dans le cas de la lignée 1698, la teneur de la graine en gossypol était significativement moindre que dans le cas des cotonniers 312 utilisés comme témoins. D'ailleurs, la teneur en gossypol de la graine crue des deux lignées se situait à l'intérieur de la gamme signalée pour le cotonnier en général. Dans l'huile de coton provenant des lignées transformées, aucune quantité détectable de gossypol n'était présente. De même, la teneur des lignées transformées en anthocyanes, en flavonoïdes et en tannins se situait dans les limites acceptables pour le cotonnier et à l'intérieur des valeurs observées chez les témoins. Enfin, la teneur en acides gras cyclopropénoïdes (acides malvalique, sterculique et dihydrosterculique) se situait dans les limites normales pour le cotonnier.

2. Composition nutritionnelle des VCN

Dans trois des six terrains d'essais situés aux États-Unis, la graine produite par les deux lignées modifiées s'est avérée essentiellement équivalente à celle provenant de la lignée témoin (Coker 312), quant sa teneur en huile, en glucides et en cendres. La teneur en protéines était légèrement mais significativement plus élevée chez les deux lignées transformées que chez les lignées témoins; cependant, elle demeurait à l'intérieur des limites normales pour le cotonnier. La Monsanto a avancé que les différences mineures de valeur nutritive observées chez les lignées transformées pouvait simplement traduire la grande variabilité de la lignée parente. Malgré les différences de teneur en protéines, les lignées transformées conservaient un profil d'acides aminés identique à celui des lignées témoins. Les teneurs en lipides et les profils d'acides gras étaient également identiques et se situaient dans les limites normales mentionnées dans les publications à l'égard de la graine de coton. Des analyses supplémentaires ont été effectuées sur des échantillons composites de produits de la graine de coton (farine non dégraissée, tourteau grillé et huile raffinée) provenant de chaque lignée, et leur composition s'est révélée semblable à celle des produits provenant de la lignée témoin. Il semble donc que le caractère nouveau qu'on a introduit chez le G. hirsutum n'aura aucun effet secondaire sur la composition et la valeur nutritive du cultivar.

VI. Décision réglementaire

Après examen des données et des renseignements présentés par la société Monsanto et après comparaison détaillée des lignées de cotonnier tolérant le Roundup® avec des contreparties non modifiées, la Section des aliments du bétail de la Division des produits végétaux conclut que les gènes nouveaux et les caractères correspondants ne soulèvent en soi aucune crainte quant à l'innocuité ou à la valeur nutritive des lignées transformées. La graine de coton et le tourteau de coton figurent actuellement à l'Annexe IV du Règlement sur les aliments du bétail. Leur utilisation est donc approuvée pour l'alimentation du bétail au Canada. Comme les lignées tolérant le Roundup® ont été déclarées, après évaluation, essentiellement équivalentes aux variétés classiques de cotonnier sur le plan de l'innocuité et de la valeur nutritive, elles et leurs produits sont considérés comme conformes à la définition actuelle d'ingrédient, et leur utilisation en cette qualité dans les aliments du bétail est approuvée au Canada. Par ailleurs, comme aucune des lignées tolérant le Roundup® ne sera cultivée au Canada et que la graine du cotonnier ne peut survivre à l'hiver dans ce pays, la dissémination de l'aliment du bétail (tourteau ou graine de coton) dans l'environnement n'aurait aucun effet, intentionnel ou non.

L'utilisation, comme aliments du bétail, de la graine et du tourteau provenant des lignées 1445 et 1698 de cotonnier tolérant le glyphosate est donc autorisée. L'utilisation à cette fin de toute autre lignée et de tout hybride intraspécifique de Gossypium hirsutum qui seraient issus de la même transformation est également autorisée, pourvu qu'aucun croisement interspécifique ne soit réalisé, que l'utilisation prévue soit semblable et qu'une caractérisation approfondie ait démontré que ces végétaux ne présentent aucun autre caractère nouveau.

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